Индукция и мониторинг активных гиперчувствительность замедленного типа (DTH) у крыс

Здравствуйте, я Кристин Битон. Я работаю в лаборатории Джорджа Чанди на кафедре физиологии и биофизики Калифорнийского университета в Ирвайне (UCI). Сегодня я покажу вам, как индуцировать активную реакцию гиперчувствительности замедленного типа (РЗГТ) у крыс.

Для этого я приготовлю эмульсию KLH, который является моим антигеном, в адъюванте Фрейнда. Затем я введу эту эмульсию в основание хвоста крыс линии Льюис. Это вызовет иммунизацию крыс против KLH. Через одну неделю я проведу провокационную пробу с KLH и измерю реакцию DTH путем измерения отека.

Это место введения антигена, и мы используем его в лаборатории, чтобы изучить влияние блокаторов PO-каналов на воспалительные реакции, такие как РЗГТ. Вот неполный адъювант Томпсона, который я буду использовать для приготовления эмульсии. Также я мог бы использовать полный адъювант Томпсона.

Перед нами кварц KLH, который сегодня служит моим антигеном; у меня есть раствор в концентрации 2 mg/ml в PBS. С помощью этого шприца объемом 5 ml я возьму неполный адъювант Трахан и перенесу его в пробирку объемом 15 ml. Затем я помещу пробирку на вортекс и, перемешивая содержимое, буду добавлять антиген в адъювант по каплям.

Затем я буду перемешивать смесь на вортексе еще в течение пяти минут. После этого я заполню стеклянный шприц объемом 5 мл полученной смесью; необходимо использовать именно стеклянный шприц, так как адъювант может разрушать пластик. Мы обнаружили, что шприцы объемом 5 мл лучше всего подходят для создания эмульсии.

Слишком маленькие или слишком большие размеры не подходят. После заполнения шприца смесью я использую этот металлический переходник, чтобы соединить данный стеклянный шприц с другим стеклянным шприцем объемом 5 мл. Затем я буду оказывать давление на шприцы, чтобы смесь перемещалась из одного шприца в другой максимально быстро, пока эмульсия не станет достаточно плотной и не будет готова к инъекции.

Теперь я добавлю 2,5 мл адъюванта. Чтобы легче извлечь адъювант, я сначала введу немного воздуха, а затем перенесу весь объем адъюванта в пробирку. Теперь я возьму 2,5 мл этого раствора и добавлю его туда, перемешивая на вортексе.

Поскольку я взял 2,5 мл адъюванта, я возьму 2,5 мл KLH. По мере того как я буду добавлять его по каплям, вы увидите, что смесь изменит цвет и станет белой. Таким образом, теперь я добавил весь антиген в адъювант.

Теперь я перемешаю смесь на вортексе в течение еще пяти минут. Чтобы не держать пробирку в руке все это время, я закреплю ее на вортексе лентой. Настройте скорость вортекса так, чтобы содержимое пробирки перемешивалось максимально интенсивно, но не переливалось через край. Я оставлю образец в таком положении на пять минут.

Итак, пять минут прошли. Теперь я выключаю вортекс; смесь приобрела белый цвет. Я достаю пробирку. Ой.

К этому моменту смесь стала полностью белой, но она все еще достаточно жидкая. Для инъекции мне потребовалась более густая консистенция. Поэтому я перенесу всю смесь в стеклянный шприц объемом 5 мл.

Эти шприцы были автоклавированы. Я соединяю один целый шприц со своим мостиком, а от второго шприца присоединяю только цилиндр.

Я оставляю поршень снаружи, после чего заливаю смесь в верхний шприц. Затем я переношу всё содержимое в нижний шприц. После этого мне нужно вытеснить образовавшийся здесь пузырек воздуха.

Теперь я отсоединяю верхний шприц и вытесняю пузырек воздуха. Пузырек трудно заметить, но он находится прямо здесь. Итак, я вытесняю пузырек воздуха.

Я также вытесняю его из соединительного мостика, после чего снова подсоединяю верхний шприц. Я проверяю плотность всех соединений, затем перекачиваю смесь из одного шприца в другой. Сначала это проходит легко, но вскоре смесь начнет густеть.

Поэтому сегодня вечером процесс становится более затруднительным, и я не хочу разрушить мостик, поэтому я просто поворачиваю шприцы. Иногда это занимает больше времени. Это варьируется от эмульсии к эмульсии.

Вероятно, это зависит от температуры и уровня влажности. Но я думаю, что моя эмульсия готова. Она стала гораздо гуще, чем была при заливке.

Раствор полностью белый. Наблюдается только одна фаза. Разделение фазы ACO и масла не должно происходить.

Теперь раствор готов к введению. Таким образом, раствор готов к инъекции. Для введения я буду использовать по 200 µL на каждое животное.

Для этого я буду использовать шприцы объемом 3 мл. Я использую шприцы с Luer-Lock, чтобы игла не выскакивала, так как эмульсия может быть очень густой, и ее будет трудно вводить. Что касается игл, я стараюсь использовать самые тонкие из возможных, которые позволяют эмульсии проходить сквозь них.

Я обнаружил, что шприцев объемом 20 3G достаточно для данной эмульсии. Для более густых эмульсий могут потребоваться шприцы большего размера. В нашей практике один человек удерживает крысу, а другой выполняет инъекцию.

Для максимальной безопасности человек, удерживающий крыс, использует специальные защитные перчатки, устойчивые к укусам грызунов; несмотря на то, что крысы очень спокойные и привыкли к манипуляциям, мы хотим полностью исключить риск укуса. Затем я переношу всю эмульсию в один стеклянный шприц и отсоединяю пустой стеклянный шприц от соединительного мостика. На его место я устанавливаю пластиковый шприц объемом 3 mL с системой Luer Lock.

Теперь я переношу больше объема, чем необходимо для одной лунки эмульсии. Я вытесняю пузырек воздуха. Поскольку я собираюсь вводить по 200 µL в каждую лунку, в шприце я оставляю 300 µL.

Я отсоединяю мостик, устанавливаю иглу на пластиковый шприц, заполняю иглу и опускаю поршень до 200 µL. Таким образом я уверен в отсутствии пузырьков воздуха. Теперь мы готовы к инъекции.

Нам необходимо убедиться, что крыса не двигается. Поэтому я захватываю крысу, помещая один палец над плечом, а другой — под плечом, и другой рукой удерживаю задние конечности и хвост. Мы будем проводить инъекции в паховые области: по несколько микролитров с одной стороны и несколько микролитров с другой. На прошлой неделе я иммунизировал крыс эмульсией, содержащей KLH в качестве антигена.

Сегодня я проведу внутрикожную сенсибилизацию крыс на спине с помощью KLH, который является моим антигеном, и овальбумина, который представляет собой соответствующий антиген. Чтобы иметь возможность ввести препараты внутрикожно в область спины, сначала мне необходимо выбрить шерсть. Для этого я использую обычную электрическую бритву. Также я меняю иглы после каждой крысы, чтобы убедиться, что игла не затупилась.

Это значительно облегчает внутрикожное введение, особенно с учетом того, что я ввожу малые объемы по 20 µL каждого антигена. Я ввел оба антигена всем крысам и оставлю их в клетках до завтрашнего дня. Завтра мы сможем наблюдать воспаление.

Таким образом, место инъекции станет красным и припухлым, и мы сможем измерить диаметр очага воспаления в качестве показателя воспалительного процесса. Вчера я ввела крысам внутрикожно в спину соответствующий антиген, KLH, и не соответствующий антиген — альбумин. Теперь, спустя 24 часа, я осмотрю крыс, чтобы проверить наличие воспаления.

Таким образом, я ожидаю возникновения воспаления только в месте инъекции KLH, которое будет проявляться в виде покраснения и отека. После обнаружения воспаления я измерю площадь поражения, просто определив диаметр этой области. Здесь находится место введения KLH, и вы можете отчетливо видеть сильное воспаление.

Эта область выглядит очень красной по сравнению с нормальной кожей и она отекла. Если теперь посмотреть на другой участок, куда вводили альбумин, здесь видно место инъекции, но значительного покраснения или отека нет. Таким образом, отрицательный контроль сработал.

Теперь я приступлю к измерению очага воспаления. Для этого я буду использовать обычную линейку и произведу измерение в миллиметрах. Данный размер составляет 6 мм, и я делаю второй замер.

Этот объект имеет размер пять миллиметров. Покраснение выражено слабо, сейчас я проведу измерение, но оно едва достигает одного миллиметра. Таким образом, я продемонстрировал вам, как подготовить эмульсию с антигеном, как иммунизировать крыс этой эмульсией, а затем, через неделю, провести реchallenge антигеном, использованным для иммунизации, а также соответствующим антигеном, и как визуализировать и измерить степень воспаления в использованной и в контрольной группах.

Мы довольно часто используем этот метод в качестве простого анализа для измерения влияния блокаторов калиевых каналов на воспаление у крыс.