Nucleofection и первичной культуры эмбриональных Мышь гиппокампа и корковых нейронов

Нейроны гиппокампа и коры головного мозга широко используются для изучения поляризации нейронов центральной нервной системы, роста аксонов и дендритов, а также формирования и функционирования синапсов; преимущество культивирования этих нейронов заключается в том, что они легко поляризуются, формируя отчетливые аксоны и дендриты на двумерном субстрате при очень низкой плотности посева. В данном видео демонстрируется метод выделения, культивирования и трансфекции эмбриональных нейронов гиппокампа и коры мыши посредством нуклеофекции, что позволяет экспрессировать флуоресцентно меченые слитые белки на ранних этапах развития, примерно через четыре-восемь часов после посева; экспрессия флуоресцентно меченых белков сохраняется на протяжении всей жизни нейрона, более двух месяцев в культуре. Это позволяет изучать функцию белков во время ранних событий развития, таких как рост аксонов, и более поздних событий, таких как синаптогенез и синаптическая пластичность.

Сначала глиальные клетки выделяют из полушарий коры головного мозга щенят мышей в возрасте от одного до трех дней после рождения и высевают во флаконы. После достижения 70–100% конфлюэнтности глиальные клетки пересевают на стеклянные покровные стекла.

Затем из мышей на стадии E 15.5 выделяют нейроны гиппокампа или коры головного мозга и трансфицируют методом нуклеоаффекции плазмидами, кодирующими флуоресцентные слитые белки, такие как красный флуоресцентный белок. Трансфицированные нейроны высевают в имиджинговые камеры для краткосрочных исследований. Для создания долгосрочных культур покровные стекла с глиальными клетками переворачивают и помещают поверх культур нейронов гиппокампа или коры для обеспечения трофической поддержки. После этого можно проводить визуализацию отдельных нейронов для изучения динамической локализации слитых белков в аксонах или дендритах нейронов.

Здравствуйте, я Эрик Дент, адъюнкт-профессор анатомии Висконсинского университета в Мэдисоне. Сегодня трое моих студентов бакалавриата — Крис Везельман, Джейсон Бве и Дерек Ломбард — продемонстрируют процедуру выделения, посева и поддержания культур корковых нейронов и нейронов гиппокампа для краткосрочного и долгосрочного культивирования. Эти культуры могут быть использованы для изучения динамики флуоресцентных слитых белков на протяжении всего развития нейронов: от начального роста нейритов до развития аксонов и дендритов, а также синаптогенеза.

Для подготовки камер к визуализации эмбриональных нейронов гиппокампа и коры мыши используйте чашки Петри диаметром 35 мм с отверстиями диаметром 15 мм в дне, очищенными от всех заусенцев. Расплавьте смесь парафина и вазелина в соотношении три к одному в конической пробирке, поместив ее в кипящую водяную баню.

Затем с помощью небольшой кисти нанесите смесь парафина и вазелина на нижнюю сторону чашки вокруг отверстия. Обязательно перемешивайте смесь парафина и вазелина перед нанесением в разные камеры, так как компоненты могут расслоиться. Поместите покровное стекло над отверстием.

После подготовки всех чашек поместите их в печь при температуре 80 °C до расплавления парафиновой смеси. Это должно занять около 10 минут. Затем извлеките чашки, установите их на плоскую поверхность и дайте парафиновой смеси застыть в течение как минимум одной минуты.

Переверните чашки и поместите их под вытяжной шкаф. Включите УФ-лампу на 30 минут, чтобы стерилизовать внутренние поверхности крышек и дно камер. Затем приступайте к нанесению покрытия.

Покрывные стекла для камер обрабатывают поли-D-лизином в течение одного часа. Затем обработанные стекла тщательно промывают от трех до пяти раз стерильной деионизированной водой, прошедшей фильтрацию, чтобы удалить все следы буфера. После финального промывания камеры высушивают с помощью вакуума. Их можно использовать сразу или хранить в помещении для культуры тканей до дальнейшего использования.

Если планируется создание долгосрочных культур, покрытые камеры следует использовать в течение одной недели после подготовки. Создание фидерных слоев из кортикальной глии необходимо начать за две-три недели до проведения диссекции коры или гиппокампа. Поместите головные мозги четырех мышей в возрасте от P1 до P3 в чашку с холодным срезом для диссекции и установите её под диссекционный микроскоп.

Удалите обонятельные луковицы, два полушария головного мозга и мозговые оболочки. Перенесите полушария в новую чашку без питательной среды. Используя чистую стерильную лезвие бритвы, максимально мелко измельчите кору головного мозга.

Затем с помощью пластиковой пипетки перенесите измельченную ткань в коническую пробирку объемом 50 мл, содержащую 12 мл холодного раствора для диссекции. Добавьте трипсин и ДНКазу до конечных концентраций 0,25% и 0,1% соответственно. Инкубируйте в водяной бане при 37 °C в течение 10 минут, периодически перемешивая содержимое круговыми движениями.

После инкубации извлеките пробирку из водяной бани и тщательно очистите ее 70% ethanol перед переносом в ламинарный шкаф для работы с тканями. Пипетируйте кортикальную ткань вверх и вниз.

Используя пипетку на 10 миллилитров, повторите процедуру примерно 10–15 раз или до тех пор, пока большинство фрагментов не исчезнет, затем верните пробирку в водяную баню еще на 10 минут, периодически осторожно перемешивая содержимое круговыми движениями. Снова тщательно протрите пробирку 70% ethanol и верните ее в ламинарный шкаф для работы с культурами тканей.

Пипетируйте ткань коры вверх и вниз. Как и прежде, используя пипетку на 5 мл, добавьте 15 мл подогретой глиальной среды и центрифугируйте при 1000 RPM в течение 10 минут. Удалите супернатант и ресуспендируйте осадок клеток в 20 мл свежей глиальной среды.

Используйте гемоцитометр для подсчета клеток. Затем высейте от 5 до 7,5 миллионов клеток в 15 миллилитров глиальной среды на одну колбу площадью 75 квадратных сантиметров. Поместите клетки в инкубатор при 37 °C; через один день и далее каждые два-три дня культивирования удаляйте все слабоприкрепленные клетки, аккуратно постукивая колбой о поверхность вытяжного шкафа.

Удалите среду вместе с любыми отслоившимися клетками и замените ее 15 миллилитрами свежей глии. Среду глии можно собирать после одной-двух недель выращивания в колбах, когда они почти достигли 100% конфлюэнтности. Чтобы подготовить отдельные покровные стекла, покрытые глией, начните с размещения шести очищенных азотной кислотой и стерилизованных.

Поместите круглые покровные стекла диаметром 25 миллиметров в чашку Петри диаметром 10 сантиметров и с помощью маленькой кисти нанесите три точки смеси парафина и вазелина в соотношении три к одному на каждое покровное стекло, располагая их в виде треугольника. Нанесите две точки по краям покровного стекла для его фиксации в чашке.

Обработайте открытые чашки УФ-излучением в течение 30 минут. Покройте покровные стекла поли-D-лизином на один час. Затем тщательно промойте их три-пять раз стерильной деионизированной водой, прошедшей фильтрацию, и высушите; извлеките глиальные клетки из инкубатора.

Удалите среду и промойте пятью миллилитрами предварительно подогретого трипсина. Добавьте в колбу три миллилитра трипсина и инкубируйте в течение одной минуты при 37 °C. После открепления клеток добавьте пять миллилитрам глиальной среды, чтобы остановить действие трипсина.

Удалите GL из колбы, совершив 10–15 циклов аспирации и экспульсии с помощью пипетки. Затем перенесите среду в коническую центрифужную пробирку объемом 15 миллилитров и центрифугируйте при 1000 RPM в течение восьми минут. После центрифугирования удалите супернатант и ресуспендируйте клетки в 10 миллилитрах глиальной среды.

Затем, после подсчета клеток, высейте 5 × 10⁵ клеток в 12,5 миллилитрах глиальной среды на чашку диаметром 10 сантиметров, содержащую покровные стекла. Заменяйте среду свежей предварительно подогретой глиальной средой каждые два-три дня. За день до выделения нейронов удалите глиальную среду и замените ее бессывороточной средой.

Используйте эту бессывороточную среду для кондиционирования глии позже. При заливе культур коры или гиппокампа добавляют C до конечной концентрации 5 µM. Чтобы предотвратить пролиферацию глии, используйте реагенты для нуклеофекции для каждой трансфекции в соответствии с инструкциями производителя, затем доведите раствор до комнатной температуры.

Поместите чашку с головным мозгом мыши на стадии E 15.5 в холодную среду для диссекции. Под диссекционным микроскопом с помощью изогнутой вольфрамовой иглы удалите оба неокортекса. Затем с помощью микропинцета удалите мозговые оболочки и перенесите кору в новую чашку с холодной средой для диссекции.

Гиппокамп и кора видны вдоль медиальной стороны полушария головного мозга; используйте небольшие ирисные ножницы. Осторожно удалите гиппокамп. Затем удалите оставшуюся часть коры.

Повторите препарирование мозга всех плодов из одного помета. Поместите кору гиппокампа в отдельные микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 миллилитра, заполненные 1 миллилитром холодного раствора для препарирования. Поместите пробирки на лед после препарирования всей коры и гиппокампов.

Добавьте 110 µL 2,5% трипсина в микроцентрифужные пробирки с тканью и поместите пробирки в инкубатор при 37 °C на 20 минут. С помощью дозатора P 1000 удалите из пробирки максимально возможный объем жидкости. Затем добавьте в каждую пробирку 1 mL среды для посева и промойте ткань, осторожно переворачивая микроцентрифужную пробирку.

Повторите промывку дважды. После окончательной промывки добавьте 1 мл среды для посева. С помощью пипетки P 1000 тритурайте агрегаты 15 раз. Затем перенесите супернатант и клетки в новую коническую пробирку объемом 15 мл, содержащую 4 мл среды для посева, оставив все оставшиеся агрегаты в микроцентрифужной пробирке.

Центрифугируйте пробирку объемом 15 мл при 350 RPM в течение семи минут, отключив торможение после завершения центрифугирования; удалите супернатант и добавьте 100 µL предварительно смешанного при комнатной температуре раствора для нуклеации для каждой трансфекции. Перемешайте содержимое, всасывая и вытесняя жидкость пипеткой пять раз, затем перенесите 100 µL смеси раствора для нуклеации и клеток в каждую новую микроцентрифужную пробирку, содержащую соответствующее количество ДНК. 1–2 µg ДНК на одну трансфекцию для долгосрочных культур позволят пометить менее 10% нейронов в культуре.

Хотя использование от 5 до 10 мкг ДНК на одну трансфекцию обеспечит более высокую эффективность трансфекции культуры, добавьте смесь суспензии клеток и ДНК в кювету для электропорации. Затем поместите кювету в электропоратор. Для нейронов ЦНС мыши установите программу NucleoEffector на 0 0 5; действуя быстро, добавьте 500 µL предварительно нагретой и уравновешенной среды для посева в кювету и перенесите клеточный раствор в новую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл.

Добавьте достаточное количество среды для посева, чтобы довести объем каждой трансфекции до одного миллилитра. После подсчета клеток высевайте от 3 до 5 × 10³ клеток/см² для молодых культур или от 5 до 10 × 10³ клеток/см² для долгосрочных культур; обычно для подготовки краткосрочных культур используют от 5 × 10⁵ до 1 × 10⁶ клеток на одну трансфекцию.

Через один час после посева залейте культуральные чашки диаметром 35 мм двумя миллилитрами подогретой бессывороточной среды, уравновешенной по CO₂. В камерах для визуализации создается очень низкое содержание сыворотки — менее 0,5%. Краткосрочные культуры не требуют культивирования с глиальным поддерживающим слоем и повторного посева. Для подготовки долгосрочных культур добавьте один миллилитр глиального кондиционированного раствора в бессывороточную среду.

Снимите покровное стекло GL, на котором нанесены три капли вазелина, и переверните его над отверстием диаметром 15 мм в чашке 35 мм. Затем добавьте еще 1 мл среды для подпитки долгосрочных культур. Заменяйте одну треть бессывороточной среды каждые два-три дня.

Через пять-семь дней культивирования добавляют цитозин арабинозид (Ara-C) до конечной концентрации 5 µM для предотвращения пролиферации глии. На следующих парных изображениях репрезентативных живых нейронов гиппокампа представлены как изображение, полученное методом дифференциального интерференционного контраста, так и соответствующая флуоресцентная микрофотография. Каждая из этих клеток была трансфецирована EGFP, тубулином и DsRed2 в pA-векторах.

На первом этапе нейроны сначала прикрепляются, а в течение примерно одного дня начинают формировать листовидные ламеллоподии и пальцевидные филоподии по периферии тела клетки. На втором этапе первичные выросты дифференцируются в несколько нейритов, исходящих из тела клетки, длина которых обычно составляет от 30 до 50 microns. На третьем этапе один из нейритов стохастически начинает быстро удлиняться, превращаясь в аксон.

Остальные нейриты остаются короткими и называются второстепенными отростками. Большинство нейронов гиппокампа и коры переходят на третью стадию через два-три дня культивирования; в течение четвертой стадии, которая длится следующую неделю или две, второстепенные отростки утолщаются, удлиняются и разветвляются, становясь дендритами, которые здесь показаны зеленым цветом. Тем временем аксон истончается по мере того, как продолжает расти и разветвляться к двум-трем неделям.

В культуре дендриты дифференцируются путем формирования дендритных шипиков — небольших выступов вдоль дендритов. Нейроны пятой стадии будут различаться по форме и размеру, однако большинство из них должны пройти через эту серию стадий развития. Трансфицированные нейроны могут не пройти эти стадии, если гиперэкспрессия белков нарушит развитие нейронов.

Кроме того, нейроны могут не пройти через все стадии развития. Если покровные стекла очищены неправильно или полилизин прикрепился недостаточно прочно, может также наблюдаться интенсивная пролиферация глии, особенно при отсутствии C. На данном изображении, полученном с помощью фазово-контрастной микроскопии, представлена двухнедельная культура, в которой в долгосрочных культурах глия разрослась, перекрыв основную культуру.

Слишком частая или, напротив, недостаточно частая смена среды также может привести к снижению жизнеспособности нейронов. На данном изображении, полученном с помощью фазово-контрастной микроскопии, представлена культура, в которой большинство нейронов погибло, а у оставшихся наблюдаются сморщенные тела клеток и четкообразные отростки. Для сравнения приведено фазово-контрастное изображение здоровых нейронов гиппокампа спустя две недели культивирования. Обратите внимание на более крупные тела клеток и отсутствие четкообразности отростков.

Кроме того, на этом этапе дендритные отростки утолщаются, и образуется обширная сеть аксональных отростков. При наличии соответствующего навыка выделение эмбриональных кортикальных нейронов, препарирование, трансфекция и посев всего помета плодов могут быть выполнены за два часа при правильном подходе. При проведении данной процедуры важно помнить, что нейроны гиппокампа и коры крайне чувствительны к механическим повреждениям.

Также важно поддерживать максимально низкую температуру растворов во время изоляции нейронов для сдерживания метаболической активности. После проведения данной процедуры можно применять другие методы, такие как прижизненная визуализация клеток и физиологическая запись активности, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, о том, как интересующие флуоресцентные слитые белки распределяются по различным областям нейрона. Это также позволяет выяснить, связана ли локализация белка с изменениями синаптической активности и как на функции этих белков влияют различные фармакологические воздействия.