Экспрессия генов с помощью электропорации одиночных клеток в культурах среза гиппокампа мышей

Начните со среза гиппокампа из мозга мыши, культивируемого на вставке культуры в чашке.

Разрежьте вкладыш, содержащий срез, и закрепите его в камере электропорации под микроскопом.

Перфузируйте камеру буфером, содержащим потенциал-зависимый блокатор натриевых каналов, чтобы подавить чрезмерное возбуждение и предотвратить клеточную токсичность.

Расположите пипетку, содержащую плазмиды с интересующим геном, рядом со срезом.

Поддерживайте положительное давление, чтобы предотвратить закупорку пипетки при приближении к целевому нейрону гиппокампа до тех пор, пока не образуется мембранная ямочка.

Переключитесь на отрицательное давление, чтобы создать уплотнение с мембраной.

Чередуйте положительное и отрицательное давление, чтобы свести к минимуму повреждение клеток.

Подайте импульс электропорации для временного проникновения в мембрану, облегчая проникновение плазмиды.

Извлеките пипетку, сохраняя положительное давление, и повторите электропорацию для соседних целевых нейронов.

Перенесите электропорированный срез в свежую вставку и инкубируйте его, чтобы обеспечить экспрессию интересующего гена.

Чтобы подготовить срезы культур для электропорации, перенесите интересующие вас вкладыши для культур в отдельные трехсантиметровые чашки Петри, загруженные 900 микролитрами питательной среды, и поместите культуры в настольный инкубатор с углекислым газом. Затем предварительно инкубируйте вкладыши свежих культур с одним миллилитром питательной среды для срезов на каждый вкладыш в чашке Петри диаметром 3,5 см в течение не менее 30 минут и стерилизуйте линии электропораторной установки 10% отбеливателем в течение пяти минут.

По окончании перфузии промойте линии ионизированной автоклавной водой в течение не менее 30 минут перед перфузией стерилизованным фильтром aCSF, содержащим 0,001 миллимолярного тетродотоксина. Установите импульс электропоратора на амплитуду минус пять вольт, квадратный импульс, последовательность 500 миллисекунд, частоту 50 герц и ширину импульса 500 микросекунд. Наполните стеклянную пипетку пятью микролитрами раствора, содержащего плазмиды, и осторожно похлопайте по наконечнику несколько раз, чтобы удалить все захваченные пузырьки.

С помощью диссекционного микроскопа убедитесь, что наконечник не поврежден, и надежно прикрепите наконечник пипетки к электроду. Когда наконечник соприкоснется с аCSF, запишите показания сопротивления пипетки электропоратора. Чтобы изолировать культуру среза, разрежьте мембрану вставки культуры острым лезвием и с помощью щипцов под острым углом осторожно перенесите культуру среза в камеру электропорации.

Затем зафиксируйте положение культуры с помощью якоря для срезов. Для электропорации интересующих клеток приложите положительное давление к пипетке ртом и с помощью трехмерных регуляторов переместите наконечник пипетки к поверхности культуры среза. Рассматривая культуру под микроскопом, приближайтесь к клетке-мишени с помощью наконечника, сохраняя приложенное положительное давление до тех пор, пока на поверхности клетки не образуется ямочка.

После визуализации ямочки быстро надавите ртом на умеренное отрицательное давление, чтобы между кончиком пипетки и плазматической мембраной образовалось рыхлое уплотнение. Мембрана будет немного входить в пипетку. Следует наблюдать примерно 2,5-кратное увеличение начального сопротивления пипетки, о чем свидетельствует увеличение тона из динамиков.

Быстро снова надавите на нее, чтобы ямочка восстановилась. Затем немедленно завершите еще как минимум два цикла давления, как только что было продемонстрировано, без паузы. После последнего импульса давления удерживайте отрицательное давление в течение одной секунды.

Когда тон динамиков достигнет стабильной вершины высоты, используйте ножную педаль для быстрого пульсации электропоратора. После электропорации осторожно втяните пипетку примерно на 100 микрон от ячейки, не прикладывая давления, и снова приложите положительное давление, убедившись, что сопротивление аналогично базовому показателю, прежде чем приближаться к следующей ячейке. Когда все интересующие клетки будут подвергнуты электропорации, перенесите культуру среза в одну из подготовленных вставок для свежих культур и поместите вкладыш при температуре 35 градусов Цельсия на срок до трех дней.