Выделение и расширение взрослой мыши нервные стволовые клетки Использование Neurosphere Пробирной

Общей целью следующих экспериментов является выделение и расширение нейростволовых клеток взрослых мышей с помощью анализа нейросферы. Это достигается путем предварительного получения мозга взрослой мыши, за которым следует вскрытие мозга под микроскопом, удаление перегородки и выделение перивентрикулярной ткани. Затем ткань измельчают и индизируют трипы для получения суспензии одиночных клеток.

Затем клетки помещают в среду нейростволовых клеток для культивирования. Здравствуйте, меня зовут Хасан Али, и я работаю с доктором Брентом Рейнольдсом в Институте мозга Макнайта при Университете Флориды. Сегодня я продемонстрирую, как изолировать и расширить нейральные стволовые клетки из мозга взрослой мыши.

Давайте перейдем в лабораторию и приступим. Обезболите двух-четырех взрослых мышей, выполните вывих шейки матки и промойте голову 70%-ным этанолом. Обезглавьте животное и с помощью небольших заостренных ножниц сделайте срединный ростральный разрез и обнажите череп.

После удаления лишней ткани шейки матки делается корональный разрез между орбитами, помещая каждое лезвие острых ножниц в орбитальную полость. Используя большое затылочное отверстие в качестве точки входа, сделайте продольный разрез через череп по сагиттальному шву. Будьте осторожны, чтобы не повредить основной мозг, следя за тем, чтобы лезвия оставались как можно более мелкими.

Опять же, используя каркас и магнум, сделайте разрез вдоль боковых сторон черепа. С помощью изогнутых щипцов захватите и снимите череп, расположенный над каждым полушарием наружу, чтобы обнажить мозг. Затем с помощью небольшого шпателя зачерпните мозг в пробирку объемом 50 мл, содержащую подогрев.

Повторяйте эту процедуру до тех пор, пока все мозги не будут собраны. После переноса мозгов в ПК два капюшона, снимите подол с тюбика объемом 50 мл и замените его свежим краем, чтобы удалить загрязнения, такие как кровь и волосы. Выполните три промывки таким образом.

Затем переложите мозги в 10-сантиметровую чашку Петри, содержащую подемку. Поместите мозг под препарирующий микроскоп и расположите каждый мозг плашмя на его вентральной поверхности, удерживая его со стороны зубца тонкими изогнутыми щипцами. С помощью другого набора щипцов удалите обонятельные луковицы.

Затем поверните мозг, чтобы обнажить вентральный аспект и сделайте корональный разрез перпендикулярно мозгу на уровне зрительного хиазма. Поместите часть мозга руля в отдельную чашку Петри с подгибом. Расположите ростральную часть мозга так, чтобы вы могли видеть поверхность разреза.

С помощью заостренных щипцов зажмите мозг и с помощью другого набора щипцов удалите перегородку. Определите мозолистое тело стриатума и перивентрикулярную область с помощью тонких щипцов. Рассеките тонкий слой ткани, окружающий боковые желудочки с каждой стороны.

Обязательно исключите сальную паренхиму и мозолистое тело. Вытяните рассеченную ткань в только что промаркированную 10-сантиметровую стерильную стеклянную чашку Петри. Повторяйте эту процедуру до тех пор, пока все мозги не будут микрорассечены.

Измельчите сгруппированную салфетку в течение одной-двух минут с помощью лезвия скальпеля, пока не останутся только очень мелкие кусочки. Используя один мл предварительно подогретого трипсина, промойте лезвие скальпеля, чтобы собрать всю прикрепленную ткань. С еще мл трипсина.

Промойте основание чашки Петри, чтобы собрать ткань. Переложите ткань в коническую двойку объемом 15 мл, чтобы не оставить после себя ткани. Третьим мл трипсина промойте основание чашки Петри, чтобы любую дополнительную ткань перенесли в тюбик объемом 15 мл.

Поместите трубку в водяную баню с температурой 37 градусов на семь минут. В конце ферментативной инкубации добавьте равный объем ингибитора трипсина в пищеварительную ткань, пипетируйте суспензию вверх и вниз, чтобы обеспечить инактивацию трипсина, а затем гранулируйте тканевую суспензию центрифугированием при 700 об/мин или 110 G в течение пяти минут. Отпылесосьте надосадочную жидкость и выбросьте ее.

Затем ресуспендируйте клетки в 150 микролитрах стерильной базальной среды нейростволовых клеток. Сбросьте дозатор на 200 микролитров, приложив кончик к нижней части трубки пипетку вверх и вниз от трех до семи раз, чтобы разбить комки до получения молочной суспензии. Чрезмерное пипетирование может привести к гибели клеток.

Добавьте еще 9,8 мл среды, чтобы получить общий объем 10 мл. Пропустите суспензию через сетчатое фильтр 40 микрометров в пробирку объемом 50 мл, чтобы удалить мусор или посторонние частицы. Затем гранулируют клетки центрифугированием при 700 об/мин до 110 G в течение пяти минут.

Отвакуумируйте S natin и восстановите. Суспензируйте клетки в одном мл полной среды нейростволовых клеток. Поскольку у нас есть клетки из двух головных мозгов, возьмите девять мл полной среды нейростволовых клеток и перенесите их в пробирку объемом 15 мл.

Смешайте один мл клеток, которые были получены из мозга двух мышей. Затем переложите в пробирку объемом 15 мл с девятью мл полной среды нейростволовых клеток. Затем добавьте BFGF для конечной концентрации 10 нанограмм на мл EGF для конечной концентрации 20 нанограмм на мл и один микролитр на мл 0,2% гепарина.

Затем смешайте клетки, которые находятся в полной среде нейростволовых клеток. С факторами роста хорошо переложите по пять мл суспензии в каждую колбу Т 25. Как правило, клетки, полученные из одного мозга, помещают в одну колбу T 25 с пятью мл полной среды нейростволовых клеток.

С факторами роста. Промаркируйте каждую колбу и перенесите в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия с 5% CO на срок от семи до 10 дней. Через семь-10 дней оцените колбу под микроскопом.

К этому времени сфера должна быть от 150 до 200 микрометров в диаметре и готова к прохождению. Соберите и переложите содержимое каждой колбы в коническую пробирку объемом 15 мл. Центрифугируйте пробирку, удалите надосадочную жидкость, смешайте гранулу с одним мл подогретого трипсина и поставьте на водяную баню 37 градусов на три минуты.

После трипсина добавить равный объем ингибитора трипсина и хорошо перемешать центрифугой. Снова удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в одном мл полной северной среды стволовых клеток. Возьмите 10 микролитров клеточной суспензии и добавьте к 90 микролитрам триамной синей.

Хорошо перемешайте суспензию и перенесите 10 микролитров этого в цитометр гемоцитометра. Выполните подсчет ячеек. Перенесите в общей сложности 10 мл полной среды для стволовых клеток медсестры в пробирку объемом 15 мл, чтобы можно было наложить две колбы T 25.

Затем смешайте клетки и добавьте соответствующее количество клеток для общей плотности 50 000 клеток на мл или 250 000 клеток на колбу T 25. Затем добавьте факторы роста, как описано выше, к которым относятся E-G-F-B-F-G-F, и гепарин. Перемешайте суспензию и переложите в колбы Т 25 в общей сложности по пять MLS на колбу.

Наконец, поместите колбы в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия и 5% CO2 для получения сфер. Это пример первичной культуры через три дня после посева. Это пример первичной нейросферной культуры через семь дней.

Как видите, здесь есть сферы различных размеров. Нейросферы становятся фазированными яркими или светящимися и становятся более сферическими. По мере увеличения размера.

Есть еще мусор. Количество мусора зависит от множества факторов, таких как микродиссекция и подготовка тканей. Обломки обычно обнаруживаются в первичной культуре неврозовой сферы у взрослых.

Это примеры перехода. Одна взрослая нейросфера через семь дней. Опять же, есть сферы разного размера, но мусора гораздо меньше.

На периферии сфер наблюдаются микрошипы, которые проявляются в здоровых сферах. Если позволить сферам вырасти слишком большими, они могут стать темными в центре из-за гибели клеток и их будет трудно диссоциировать. Мы надеемся, что это видео будет для вас полезным.

Помните, не позволяйте сферам разрастаться слишком большими, так как они могут прикрепляться к субстрату и дифференцироваться, а также их будет трудно подкультивировать. Вам нужно передавать свои копья каждые семь-10 дней в зависимости от их размера и внешнего вида. Удачи в вашем эксперименте.