Трансфекции правам нервные стволовые клетки с Amaxa Nucleofector

Здравствуйте, меня зовут Стив. Я работаю в лаборатории доктора Флэнагана на кафедре патологии Калифорнийского университета в Ирвайне. Сегодня я покажу вам, как проводить трансфекцию нейральных стволовых клеток человека с использованием ядерного фактора Maxis.

Для начала вам потребуется большое количество клеток. Я бы рекомендовал использовать как минимум один конфлюэнтный флакон T 25, так как данный протокол требует очень высокой плотности клеток, поэтому вам понадобится не менее миллиона клеток. Сначала я сниму клетки с поверхности, используя буфер для диссоциации клеток, а затем проведу их подсчет.

Для выполнения этой процедуры обратитесь к моему протоколу подготовки образцов. Причина, по которой я предпочитаю систему Amaxa для экспериментов по трансфекции, заключается в том, что компания Amaxa разрабатывает специализированные протоколы трансфекции для конкретных типов клеток, в моем случае — для нейральных стволовых клеток, и они отлично работают.

Этот метод обеспечивает очень высокую эффективность трансфекции и очень высокую жизнеспособность клеток. Итак, приступим. Теперь я готов провести трансфекцию.

Таким образом, при подготовке к этой трансфекции я заранее покрыл чашку для культивирования тканей фибрином, выдержав ее в течение ночи. После этого я добавил в нее ростовую среду. Сейчас чашка находится в инкубаторе в ожидании внесения клеток.

Также я подготовил все реагенты, векторную ДНК и раствор для трансфекции. Все они находятся здесь на льду. Теперь я готов приступить к трансфекции.

Это ядерный фактор M max; перед тем как поместить его в вытяжной шкаф, я продезинфицирую его 70% ethanol, а затем протру бумажным полотенцем. Я провел подсчет клеток, чтобы в итоге получилось 4 миллиона клеток, и подготовил их. Теперь я готов приступить к трансфекции.

Сначала я удалю среду, в которой находятся клетки. Перед нами клеточный осадок, и я аспирирую среду из него. Я постараюсь удалить как можно больше среды, так как не хочу, чтобы в среде для трансфекции присутствовали какие-либо белки или другие вещества, поскольку это может повлиять на протокол трансфекции.

Я удалил практически всю среду, и теперь я ресуспендирую этот осадок клеток в 100 µL специально разработанного раствора ядерного фактора для нейральных стволовых клеток мыши. Компания Mxa производит раствор для трансфекции нейральных стволовых клеток мыши; раствора для человеческих нейральных стволовых клеток у них нет, но мы обнаружили, что использование раствора для клеток мыши работает очень хорошо. Таким образом, я добавлю 100 µL этого раствора ядерного фактора для нейральных стволовых клеток мыши.

Теперь я тщательно ресуспендирую осадок клеток, чтобы не осталось никаких клеточных агрегатов. Таким образом, я получу гомогенную клеточную суспензию. Для этого я буду pipetтировать суспензию вверх и вниз примерно 10 раз.

Я считаю, что теперь у меня получилась достаточно гомогенная смесь, и сейчас я перенесу ее в открытую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл. Я использую дозатор P 1000 и постараюсь перенести весь этот раствор. Таким образом, у меня есть 4 миллиона клеток, ресуспендированных в новом растворе для трансфекции мышиных клеток, и теперь я добавлю 5 µL вектора.

Все это время я держал образец на льду. Теперь я сначала возьму 5 µL и добавлю их в суспензию клеток.

Теперь я воспользуюсь дозатором P 200, настроенным примерно на 50 µL, и очень тщательно перемешаю клетки с вектором. Для этого я перемешаю содержимое, 10 раз всасывая и вытесняя жидкость пипеткой. Готово.

Теперь я готов к трансфекции. Я открою новую кювету, а также возьму специальный дозатор, предоставленный компанией Amaxa.

Теперь я сниму крышку и осторожно перемешаю содержимое. Затем я введу пипетку до самого дна пробирки и аккуратно выжму раствор. Теперь я включу max nuclear factor, установлю значение 33 0 3 3 и нажму enter.

Затем я помещу кювету в держатель для кювет, поверну колесо, и теперь я готов к трансфекции. Но перед этим я удостоверюсь, что у меня готова теплая среда, которую можно будет сразу добавить к трансфецированным клеткам. Добавление теплой среды в кювету сразу после трансфекции помогает повысить жизнеспособность клеток.

Я подготовлю дозатор P 1000. Также я возьму планшет с питательной средой, который сейчас находится в инкубаторе, чтобы сразу же перенести клетки в среду. Теперь я снова нажму Enter, и всё готово.

При успешной трансфекции, как вы можете видеть, образуется очень плотный слой пузырьков, что указывает на успешный процесс. Теперь я добавлю 500 µL предварительно нагретой среды в vete. Таким образом, я добавляю среду, которая крайне необходима клеткам, и буду использовать тот же дозатор MX, чтобы извлечь клетки из vete.

Поскольку сейчас они находятся в состоянии сильного стресса, я перенесу их непосредственно в теплую среду, добавив еще больше теплой среды. И, наконец, на последнем этапе я промою Q vete еще порцией предварительно нагретой среды, чтобы убедиться, что все клетки извлечены, затем помещу всё это в ту же лунку L и немедленно поставлю планшет в инкубатор.

На этом изображении представлены нейральные клетки-предшественники человека, которые были трансфицированы ядерным фактором доступа и высеяны на покровные стекла с сеткой. Таким образом, даже через два дня после трансфекции эффективность трансфекции составляет около 50%, что можно наблюдать по экспрессии GFP. Сегодня я продемонстрировал вам способ трансфекции нейральных клеток-предшественников человека с использованием ядерного фактора Xis.

Желаем успехов в проведении трансфекции.