Микрофлюидное моделирование и флуоресцентное отслеживание роста бактерий в одиночных клетках

Начните с бактериальной культуры с флуоресцентной меткой, добавленной в безуглеродный буфер.

Центрифуга, чтобы удалить бактерии и выбросить надосадочную жидкость.

Повторно суспендируйте гранулу в свежем безуглеродном буфере, содержащем мягкое моющее средство.

Отсутствие источника углерода останавливает рост, в то время как моющее средство предотвращает образование комков и поддерживает клетки в подвешенном состоянии.

Загрузите бактериальную суспензию в шприц и подключите ее к насосу.

Введите суспензию во входное отверстие микрофлюидного чипа, содержащего канал с заложенными в пол ловушками.

Медленно извлеките жидкость из выходного отверстия канала.

По мере того, как жидкость отступает, капиллярные силы направляют бактерии к выходу.

В этом процессе отдельные бактериальные клетки оседают в ловушках, что приводит к образованию бактериального узора.

Постоянно промойте канал подогретым, богатым питательными веществами бульоном.

Бактерии возобновляют рост и образуют микроколонии внутри ловушек.

Используйте флуоресцентную микроскопию для получения покадровых изображений и анализа роста бактерий в контролируемой среде.

Нанесите пипеткой один миллилитр среды MOPS во флакон центрифуги и добавьте 10 микролитров 0,132 молярного калийфосфата.

Добавьте 100 микролитров ночной культуры в флакон центрифуги и центрифугируйте культуру в 2300 раз г в течение двух минут. Аккуратно выбросьте надосадочную жидкость для ресуспендирования гранулы в одном миллилитре свежей среды MOPS с 0,015% Tween 20 и 0,01% фосфата калия и загрузите бактериальную суспензию в одномиллилитровый шприц. Чтобы зафиксировать шприц и соединение трубки, вставьте иглу непосредственно в трубку.

Теперь установите шприц на шприцевой насос и впрыскивайте суспензию в микрофлюидный чип через входное отверстие, расположенное в верхней части канала, пока суспензия не покроет область шаблона ловушками. Установите шприцевой насос на расход от 0,07 до 0,2 микролитра в минуту для удаления бактериальной суспензии и контролируйте процесс структурирования с помощью программного обеспечения микроскопа. После того, как шаблон будет смоделирован с помощью ячеек, увеличьте скорость потока на выходе, чтобы быстро опорожнить микрофлюидный канал, и промойте его свежим LB, который был предварительно дегазирован в течение не менее 30 минут и предварительно нагрет до 30 градусов Цельсия.

Теперь установите шприцевой насос на скорость потока два микролитра в минуту, чтобы аккуратно промыть канал. Как только канал будет заполнен, снова увеличьте расход. Получение изображений растущих бактерий с нужным увеличением и временным интервалом.