Micropatterned Поверхности по изучению Гиалуроновая кислота Взаимодействие с раковыми клетками

Инвазия и прогрессирование рака связаны с изменением фенотипа клеток, который находится под комплексным регулированием факторов роста, цитокинов и компонентов внеклеточного матрикса в микроокружении опухоли. Гиалуроновая кислота (ГК) представляет собой один из компонентов стромального внеклеточного матрикса, который, как известно, способствует прогрессированию опухоли, усиливая инвазивный рост и ангиогенез посредством взаимодействия ГК с ее клеточным поверхностным рецептором CD 44. Это взаимодействие индуцирует сигнальные события, которые стимулируют рост, выживаемость и миграцию опухолевых клеток, тем самым увеличивая метастатическое распространение; данная работа направлена на изучение адгезии, миграции и роста раковых клеток на экзогенной ГК.

Стандартная фотолитография используется для изготовления микроструктурированного эластомерного штампа, который затем применяется для создания структурированного массива молекул аминосилана на стеклянных подложках. Далее проводится реакция с использованием карбодиимида для ковалентного присоединения HA к микроструктурированному аминосилану. Таким образом создаются микроструктуры HA, на которые затем можно высеять культивируемые раковые клетки; взаимодействие раковых клеток с экзогенной гиалуроновой кислотой можно визуализировать с помощью световой микроскопии, методов визуализации высокого разрешения, таких как сканирующая электронная микроскопия или иммунофлуоресцентная микроскопия.

Метод создания микроструктурированных поверхностей из гиалуроновой кислоты (ГК), представленный в данной видеостатье, может помочь в решении ключевых вопросов в области исследований рака, таких как дальнейшее выяснение роли экзогенной гиалуроновой кислоты в прогрессировании опухоли. Для изготовления штампа из полиметилсилоксана (PDMS) с микрорельефом, который будет использоваться для импринтинга стеклянных предметных стекол ГК, начните с того, что возьмите новый кремниевый пластин с помощью пинцета.

Затем перенесите пластину над лабораторной раковиной. Используя промывочную бутылку, промойте пластину этанолом и высушите струей воздуха. Выключите свет в помещении.

Затем с помощью пинцета перенесите подложку на центрифугу для нанесения покрытий, используя переносную пипетку; покройте не менее 80% поверхности подложки негативным фоторезистом SU 2025. Выполните центрифугирование в течение 10 секунд при 600 RPM, затем в течение 30 секунд при 3000 RPM. Перенесите подложку с нанесенным фоторезистом на нагревательный стол и проведите предварительный запек при 95 °C в течение трех минут. Затем снимите ее с нагревательного стола и дайте остыть в течение одной минуты.

Поместите изготовленную заранее маску с нужным рисунком на поверхность пластины, покрытой фоторезистом, и подвергните УФ-облучению в течение 20 секунд. Затем перенесите пластину на нагревательную плитку и проведите окончательный запек при 110 °C в течение шести минут.

Включите свет и снимите пластину с нагревательного столика. На данном этапе должны быть видны отчетливые узоры с помощью переносной пипетки. Тщательно промойте пластину проявителем фоторезиста SU-8; после трехкратного промывания раствором проявителя промойте пластину этанолом.

При наличии белого осадка повторите промывку раствором проявителя фоторезиста или просто погрузите пластину в раствор проявителя на две минуты, затем снова промойте этанолом, вымойте водой и высушите струей воздуха в большом лотке для пластин. Смешайте раствор эластомера PDMS и отвердитель в весовом соотношении 10:1; для пластины, показанной здесь, достаточно 22 граммов. Перелейте смесь в центрифужную пробирку и центрифугируйте при 900 об/мин в течение пяти минут.

Для удаления пузырьков воздуха поместите структурированную подложку в чашку Петри подходящего размера. Налейте на нее достаточное количество раствора PDMS, чтобы полностью покрыть подложку слоем толщиной около четверти дюйма. Если на поверхности подложки присутствуют пузырьки, поместите ее в вакуумный эксикатор до их полного исчезновения.

Оставьте для отверждения на ночь при комнатной температуре до образования соответствующего эластомерного штампа. Если PDMS не отвердел полностью через 12 часов, поместите пластину в печь при 60 °C на 30 минут. Осторожно отделите PDMS от пластины.

Затем с помощью лезвия обрежьте штамп до нужного размера. Поместите штамп в стеклянный стакан с этанолом, желательно в пластиковом держателе, и подвергните воздействию ультразвука в течение 15 минут. Пластины можно использовать многократно для создания новых эластомерных штампов с целью ковалентной иммобилизации ha на стеклянных поверхностях в виде определенных участков.

Начните с очистки всех предметных стекол, которые будут использоваться, в плазменном очистителе согласно инструкциям, приведенным в сопроводительном тексте. После очистки извлеките предметные стекла из плазменного очистителя с помощью пинцета. Поместите стекла в пластиковую чашку Петри и отставьте их для дальнейшего использования.

Затем в полистирольной центрифужной пробирке объемом 15 мл приготовьте аминосилановый раствор для нанесения на предметное стекло с целью связывания HA. Приготовьте свежий 3% (об/об) раствор 3-аминопропилтриметоксисилана (A-P-T-M-S) в 95% (об/об) этаноле общим объемом 5 мл; дайте раствору прореагировать в течение пяти минут при комнатной температуре.

В течение этого периода A-P-T-M-S в результате гидролиза превращается в силанол. Затем, придерживая изделие только за края, поместите штамп из PDMS рисунком вверх на зажим центрифуги. С помощью transfer-пипетки покройте поверхность рисунка A-P-T-M-S.

Затем нанесите A-P-T-M-S на поверхность штампа методом центрифугирования при 3 500 об/мин в течение 30 секунд. После извлечения штампа из ПДМС-центрифуги переверните его так, чтобы сторона с рисунком была направлена вниз, поместите один край штампа из ПДМС в центр предметного стекла и осторожно прижмите, чтобы весь штамп контактировал с предметным стеклом в течение одной минуты. Затем аккуратно снимите штамп из ПДМС и оставьте предметное стекло с нанесенным рисунком из A-P-T-M-S при комнатной температуре.

Через 30 минут промойте поверхность рисунка этанолом и высушите струей воздуха. Обработайте штамп из PDMS в ультразвуковой ванне в течение 15 минут, чтобы удалить излишки A-P-T-M-S. Затем поместите предметные стекла на нагревательную плиту на один час при температуре 115 °C для нагрева поверхностей и удаления излишков воды.

Промойте этанолом и высушите на воздухе с помощью пинцета. Перенесите предметное стекло с паттерном в стеклянную чашку Петри. С помощью переносной пипетки полностью покройте предметное стекло свежеприготовленным раствором полиэтиленгликоля (PEG) или раствором PEG-cline, который будет служить неадгезивной областью вокруг паттернов.

После инкубации в течение 45 минут при 75 °C слейте избыток физиологического раствора PEG. Затем, удерживая предметное стекло пинцетом, промойте поверхность структурированных предметных стекол толуолом, затем снова водой и высушите струей воздуха. Поместите стекла в увлажненный контейнер для предметных стекол.

Затем поместите контейнер в бокс биологической безопасности и включите УФ-лампу на один час для проведения бактерицидного облучения. Далее все действия выполняйте внутри бокса биологической безопасности. Для обеспечения стерильности вне вытяжного шкафа приготовьте один миллилитр стерильного водного раствора HA с концентрацией 10 millimolar.

1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид (EDC) в концентрации 5 mM и N-гидроксисукцинимид (NHS) в концентрации 50 µg/mL. Стерильный меченный флуоресцеином HA EDC представляет собой сшивающий агент нулевой длины, который реагирует с карбоксильными группами HA с образованием аминореактивных интермедиатов. Поскольку этот интермедиат подвержен гидролизу, для повышения эффективности реакции с карбодиимидом добавляют NHS.

Затем нанесите стерильный раствор HA аликвотами по 200 microliter на структурированное стекло до полного покрытия структурированной области. Закройте контейнер для предметных стекол, чтобы защитить их от света. Подложки с рисунком следует оставить в вытяжном шкафу в состоянии покоя на 16–24 hours; в ходе взаимодействия раствора HA с микроструктурированным A-P-T-M-S-A формируется стабильная связь MI между промежуточным соединением HA и первичным амином A-P-T-M-S.

На следующий день с помощью пипетки-аспиратора APA удалите раствор HA. Промойте предметные стекла раствором PBS, затем покройте поверхность 1% BSA в PBS на один час. Теперь поверхность готова для культивирования клеток.

Поместите поверхности с микрорисунком из HA в стерильную чашку Петри для культивирования на поверхностях с микрорисунком из HA. Рассейте суспензии одиночных раковых клеток с плотностью от 0.4 до 1 × 10⁶ раковых клеток на 18.75 cm² стеклянной поверхности в 1 мл клеточной среды, чтобы покрыть поверхность предметного стекла; осторожно поместите клетки в увлажненный инкубатор при 37 °C с 5% CO2. При условии, что среда не проливается, адгезия клеток должна произойти в течение 24 часов, что можно наблюдать с помощью инвертированного светового микроскопа.

Поверхности с клеточными культурами можно поддерживать до пяти дней. В стандартных условиях инкубатора заменяйте среду через день. Морфологию и рост клеток можно наблюдать с помощью инвертированного светового микроскопа.

Затем могут быть применены дополнительные клеточные тесты для анализа ответов на поверхность HA в представленном здесь примере. Поверхность с рисунком из HA, визуализированная с помощью флуоресцентного микроскопа и изображения. Анализ интенсивности флуоресценции J демонстрирует демобилизацию рисунка ha.

Поверхности с микроузорами из HA позволяют изучать взаимодействие раковых клеток с экзогенной HA. Здесь показана адгезия раковых клеток на поверхностях с микроузорами из HA. Клетки карциномы толстой кишки и молочной железы преимущественно адгезировали на участках HA в течение 24 часов культивирования. Для анализа взаимодействия культивируемых клеток с поверхностями с иммобилизованной HA можно использовать визуализацию высокого разрешения с помощью сканирующей электронной микроскопии.

На этой микрофотографии, полученной с помощью сканирующего электронного микроскопа, видно взаимодействие клеток рака толстой кишки с HA; справа представлено изображение с более высоким увеличением. Здесь снова показаны клетки рака молочной железы, культивируемые на поверхностях HA; справа представлено изображение с более высоким увеличением. Этот анализ четко демонстрирует наличие адгезивных выростов, которые способствуют распластыванию раковых клеток на микропаттернах HA.

После просмотра данного видео вы должны получить четкое представление о том, как подготавливать микропаттерны из HA и использовать их для изучения ответа раковых клеток.