Механическое раздражение Стволовые клетки Использование Циклические одноосной деформации

Здравствуйте, я Сон Ли, доцент кафедры биоинженерии Калифорнийского университета в Беркли. А я Кайл Капински, аспирант (PhD candidate) также на кафедре биоинженерии Калифорнийского университета в Беркли.

Сегодня мы представим протокол механической стимуляции стволовых клеток с использованием циклической одноосевой деформации. Исследования в нашей лаборатории сосредоточены на инженерии клеток и тканей, особенно в сердечно-сосудистой системе. Нас интересует механическая биология стволовых клеток, поскольку существует несколько потенциальных областей применения.

Во-первых, мы хотим понять влияние механических факторов на развитие, например, на эмбриональное развитие. Во-вторых, нас интересует управление дифференцировкой стволовых клеток in vitro или в биореакторах. И в-третьих, нам интересно, как стволовые клетки реагируют на сердечно-сосудистые механические факторы in vivo, например, после трансплантации.

Для исследования всех этих аспектов мы используем биореактор специальной конструкции, в котором можно высевать клетки на эластичные мембраны, а затем растягивать эти мембраны в течение определенного времени, при заданной степени деформации и заданной скорости деформации. Теперь мы подробно разберем все этапы, которые необходимо выполнить для реализации данного протокола. Используя лабораторное мыло (подойдет любой моющий агент), нанесите его на обе стороны мембраны и тщательно протрите поверхность, чтобы удалить любые частицы загрязнений на мембране. Удалите всё, что может помешать росту клеток.

Я делаю это вручную. Затем, когда я убеждаюсь, что обе стороны достаточно хорошо очищены, я еще раз промываю их водой. После этого я хочу убедиться, что образец действительно стерилен и все микрочастицы удалены.

Теперь я возьму эту мембрану и помещу её в стакан с 70% спиртом. Нужно полностью погрузить её в раствор. После этого стакан целиком помещают в ультразвуковую баню и подвергают воздействию ультразвука в течение 10 минут.

Теперь, когда микропаттернированная мембрана находится в квадратном планшете, мы хотим убедиться, что сторона с паттерном обращена к нам. Для этого я возьму распылитель со спиртом и опрыскаю верхнюю сторону мембраны. Теперь видно, как жидкость стекает по поверхности, обнажая эти канавки.

Таким образом, подтверждается, что сторона с рисунком обращена вверх и ориентация выбрана правильно. Теперь, когда этап ночного УФ-облучения завершен, вы видите, что все камеры, все рамки для камер и сами мембраны находятся в вытяжном шкафу, где они подвергались воздействию УФ-излучения в течение ночи. Это наш заключительный этап стерилизации.

Теперь я хочу обработать все мембраны плазмой; я буду доставать по одной или две мембраны за раз, оставляя их в стерильных чашках, и переносить их к установке для плазменной обработки. Теперь вакуумное давление спало, и я могу снять камеру. Опять же, это не полностью стерильно, но мы повторим это позже.

Работая относительно быстро, чтобы плазма оставалась на мембране, используйте пинцет. И снова подчеркнем: это крайне важно. Убедитесь, что вы не уронили мембрану и не изменили ее ориентацию.

На данный момент плазменная обработка была проведена только на верхней поверхности; теперь я помещу мембрану обратно в относительно стерильную чашку обработанной стороной вверх, закрою крышку и перенесу её в ламинарный шкаф. Теперь, когда мембрана прошла плазменную обработку, я помещу её обратно в шкаф и обработаю 2% желатином. Концентрация указана как масса на объем.

Видно, что раствор по-прежнему вытекает в соответствии с рисунком. Кроме того, поверхность очень гидрофильна благодаря обработке плазмой. Таким образом, раствор растекается, а не собирается в каплю; если бы вы случайно перевернули мембрану, раствор бы собрался в каплю, и вы бы поняли, что используете неправильную сторону.

Убедитесь, что раствор распределился равномерно. После того как вы повторите эту процедуру для всех мембран, просто закройте вытяжной шкаф и включите УФ-лампу на 30 минут. Таким образом, мембрана находилась под воздействием УФ-излучения с нанесенным на поверхность желатином в течение получаса, чего достаточно для абсорбции желатина поверхностью.

На данном этапе мне необходимо дважды промыть мембрану стерильным PBS; обычно я наливаю около 10 мл раствора в квадратный кювет и аккуратно промываю мембрану, перемещая ее рукой, стараясь не касаться ее поверхности, после чего аспирирую PBS. Я повторю эту процедуру еще раз, и после второго раза оставлю мембрану в PBS — это поможет увлажнить мембрану, что облегчит ее установку в камеру. Если оставить мембрану сухой, возрастает вероятность того, что она порвется или будет повреждена.

Это вторая промывка. Снова аспирируйте жидкость один раз, чтобы убедиться, что весь желатин удален с мембраны. Затем оставьте мембрану примерно в 10 milliliters стерильного PBS.

Если вы работаете с несколькими мембранами, повторите этот процесс для каждой из них. После этого можно приступать к сборке. Возьмите одну из рамок; фактически она состоит из двух частей, но обычно они поставляются в предварительно собранном виде.

Таким образом, одна часть представляет собой Т-образный соединитель, а другая часть — элемент рамы, в которой будет закреплена сама мембрана. Существует вторая часть рамы, которая выглядит следующим образом. Как видно, в ней имеется специальный паз.

Сюда будет вставляться прокладка для фиксации мембраны. Вторая деталь имеет второй паз для другой прокладки, чтобы зафиксировать мембрану с обеих сторон. Возьмите эту деталь, установите ее на раму следующим образом, переверните раму и возьмите один из винтов автоклава.

Вставьте винт сверху; сначала можно немного затянуть его вручную, а затем полностью затянуть одним из шестигранных ключей. Таким образом, на данном этапе у меня собрана рама, и мембрана будет устанавливаться на нижнюю сторону — таким образом, как если бы моя рука была мембраной. Это означает, что я хочу, чтобы была обращена сторона, которая имеет текстуру и/или прошла плазменную и желатиновую обработку.

Я хочу, чтобы эта сторона была обращена вверх. Если я случайно переверну его и сторона с желатином окажется снизу, это станет серьезной проблемой для эксперимента. Поэтому при сборке я хочу, чтобы сторона с рисунком была направлена вверх, но собирать я буду его в перевернутом виде.

Поэтому, извлекая мембрану, убедитесь, что сторона с рисунком обращена вниз. Взяв одну мембрану (помните, что сейчас сторона с рисунком обращена вверх), я достаю ее из PBS и таким образом укладываю на рамку.

Таким образом, сейчас обе стороны примерно равны. Края мембраны можно касаться пальцами, но старайтесь не касаться противоположной стороны. Теперь, когда я перевернул её таким образом, сторона с рисунком направлена вниз, что облегчит сборку; возьмите две прокладки и поместите их в PBS.

Я обычно перекатываю его туда-сюда. Таким образом, я смачиваю всю прокладку, и это смазывает прокладку точно так же, как я смазывал мембрану в PBS. Если использовать сухие прокладки с сухой мембраной, вероятность того, что что-то сместится, гораздо выше.

Я начинаю с того, что вытягиваю одну сторону чуть сильнее, чем другую, потому что при установке прокладки она будет тянуть мембрану в эту сторону, и тогда эта сторона станет немного короче. Поэтому начните с того, чтобы оставить здесь укороченный край. Возьмите одну прокладку и расположите ее так, чтобы она лежала ровно с обеих сторон.

Равномерно надавите вниз, используя большие пальцы или их кончики, но не ногти, так как в этот момент выше вероятность случайно прорезать или порвать мембрану. После того как я вставил ее, я использую тыльную сторону своих пинцетов, чтобы надавить. И снова будьте осторожны, чтобы не давить слишком сильно и не соскользнуть, коснувшись мембраны, так как на этом этапе вы можете случайно разрезать или порвать ее, и тогда вам придется взять новую мембрану и начать всё сначала.

Теперь одна сторона вставлена, но вторая всё еще остается свободной. Переверните образец, возьмите вторую прокладку, убедитесь, что она увлажнена, и поместите ее сверху точно так же, как и в первый раз. Затем я обычно использую пинцет, чтобы захватить мембрану и немного ее растянуть, так как при излишней слабине мембрана будет провисать, и увидеть клетки станет невозможно.

Таким образом, мембрана должна быть натянута, но не слишком сильно, чтобы избежать чрезмерного растяжения. Если она будет перенатянута, это повлияет на эксперимент, так как мембрана уже будет находиться под напряжением, и вы можете ее порвать, когда будете прижимать прокладку. На данном этапе она выглядит достаточно натянутой.

Возможно, с одной стороны оно сидит немного неплотно, но я сейчас это исправлю. Снова, прикладывая равномерное давление, просто нажмите кончиками больших пальцев или подушечками пальцев. И на данном этапе видно, что одна сторона натянута достаточно плотно.

Она проходит прямо на всю ширину противоположной стороны. Здесь мембрана немного провисает и слегка закручивается. Поэтому я прижму эту сторону до конца, как и в предыдущий раз, делая это медленно и равномерно по всей длине прокладки.

Как видно, это позволило устранить большую часть провисания. Таким образом, мы завершили 30-минутное УФ-облучение обратной стороны рамок и мембран; теперь необходимо перевернуть все мембраны, чтобы облучить их с лицевой стороны для обеспечения полной стерильности. На данном этапе мы также определим соответствующие камеры как камеры растяжения или контрольные камеры.

Как видите, я уже промаркировал свои камеры: «контроль», «растяжение», «контроль», «растяжение». Для камер с растяжением требуется один дополнительный винт. Поэтому я положил дополнительный винт для камеры с растяжением на внутреннюю сторону крышки.

Просто возьмите рамку и переверните ее. Если это камера растяжения, значит, мне нужно заменить пару винтов. Если же это контрольная камера, то все остается без изменений.

И когда эта перекладина перемещается вперед-назад, сама мембрана не растягивается, а просто двигается вместе с перекладиной. Чтобы мембрана растягивалась, мне нужно закрепить вторую часть рамки с этого конца в нижней части камеры, чтобы она оставалась неподвижной. Тогда при перемещении перекладины только эта часть рамки будет двигаться вперед и назад.

Для этого возьмите дополнительный винт и вставьте его в отверстие в данной части рамы. С помощью шестигранного ключа затяните винт. Не затягивайте его слишком сильно, так как полисульфоновые камеры довольно хрупкие, и важно не допустить их растрескивания; затяните винт ровно настолько, чтобы эта часть рамы была зафиксирована и не смещалась.

После того как вы закрутите первый винт, можно выкрутить этот винт, который удерживал две части рамы вместе; будьте осторожны, чтобы не уронить его на мембрану, так как это может повредить часть желатина, который вы нанесли. Когда винт будет достаточно ослаблен, возьмите шестигранный ключ, захватите винт пинцетом и поместите его во второе отверстие. Затем снова с помощью шестигранного ключа затяните второй винт.

После того как эта часть рамы будет закреплена двумя винтами, камера будет готова к растяжению. Когда эта штанга будет перемещаться вперед и назад в установке для растяжения, вы увидите, что сама мембрана фактически будет растягиваться. Я предпочитаю повторить эту процедуру несколько раз, чтобы убедиться в целостности мембраны.

Если по какой-то причине возникла трещина и мембрана порвалась, теперь я узнаю об этом до начала эксперимента и смогу установить другую мембрану. Таким образом, вы отодвигаете эту часть в сторону, берете следующую, которая в данном случае обозначена как контрольная камера. Для контрольной камеры мне нужно всего лишь перевернуть ее.

Теперь, после установки в прибор, устройство будет перемещаться вперед и назад без растяжения. Затем повторите этот процесс для всех имеющихся камер и мембран. Каждую из них следует либо подвергнуть контрольному растяжению, либо просто закрыть вытяжной шкаф и облучить верхние стороны мембран УФ-излучением в течение 30 минут.

Мы завершили УФ-облучение всех камер, верхних сторон рамок и мембран в течение 30 минут. Теперь все стерильно, собрано, и мы готовы к посеву клеток. В данном случае я высеваю мезенхимальные стволовые клетки, которые я беру из чашек диаметром 10 см.

Таким образом, для каждой мембраны, особенно если используется паттернированная мембрана, как в данном случае, можно посеять клетки в квадратной области, где расположен паттерн. Я хочу произвести посев только на этой паттернированной области. Если вы используете мембрану без паттерна, все равно следует производить посев примерно в той же области, чтобы жидкость не оказалась слишком близко к краям.

Если жидкость находится слишком близко к краям, она может вылиться, и тогда клетки погибнут до того, как вы успеете их полноценно посеять. В той области, где вы проводите посев, необходимо разместить соответствующее количество клеток. Поэтому при проведении эксперимента я стремлюсь к тому, чтобы в этой области наблюдалась высокая степень конфлюэнтности.

Таким образом, если я использую чашку диаметром 10 см, мне нужно, чтобы примерно треть этой площади была покрыта монослоем клеток. В данном случае для мезенхимальных стволовых клеток это примерно 250 000 клеток. Это число будет меняться в зависимости от используемого типа клеток.

Я уже снял клетки с планшета и ресуспендировал их в соответствующем объеме. Теперь мне нужно нанести по 1 мл клеточного раствора на каждую мембрану. В данном случае концентрация составляет примерно 250 000 мезенхимальных стволовых клеток на 1 мл раствора.

Я использую дозатор P 1000. Чтобы раствор стал однородным, я несколько раз перемешиваю его, набирая и вытесняя жидкость, затем набираю 1 мл в дозатор. Мне нужно убедиться, что посев осуществляется только в этой области, поэтому я высеваю клетки очень медленно, нанося жидкость маленькими каплями на структурированную область.

И вы действительно можете видеть, что из-за наличия этого паттерна образуются маленькие овалы в данном направлении, так как система фактически реагирует на эти бороздки. Таким образом, они не являются полноценными кругами. В данном случае они имеют более овальную форму.

Затем я осматриваю всю эту область, стараясь пока не приближаться слишком близко к краям. Я не хочу зайти слишком далеко и израсходовать весь раствор из пипетки. После этого я использую пипетку, чтобы фактически распределить раствор по всей поверхности вплоть до краев, стараясь не выходить за их пределы.

Я не хочу, чтобы на непрошедшем участке оставались какие-либо клетки, а край, расположенный ближе всего к вам, обрабатывать довольно сложно. Поэтому обычно я осторожно вращаю образец, чтобы обработать этот последний край. Это должно обеспечить достаточно равномерное распределение клеток.

Теперь они все осели на дно. Но будьте осторожны, чтобы не расплескать клетки. Поэтому старайтесь не проводить рукой над емкостью и не перемещать ее слишком быстро.

Затем я снова отодвигаю его. Я хочу закрыть это и просто оставить посеянные клетки сверху. Чтобы закрыть это, используйте данную крышку, на которой на самом деле есть два разных отверстия.

С этой стороны находится более глубокое отверстие, а с этой — более мелкое, через которое поступают газы. Необходимо убедиться, что более глубокое отверстие совмещено с этой Т-образной частью. В противном случае, при использовании мелкого отверстия, соединение будет слишком плотным.

Установив его таким образом, вы перекроете всю камеру. Затем повторите этот процесс для всех остальных камер и оставьте их в ламинарном шкафу на 30 минут, чтобы клетки осели на дно и начали прикрепляться к мембранам. После этого заклейте все камеры скотчем и переместите их из шкафа в инкубатор, где они должны находиться еще один час для полного прикрепления к мембранам.

Итак, мы завершили этап выдержки клеток на мембранах в течение получаса. Теперь мне нужно поместить клетки в условия 37 °C и 5% CO2, которые поддерживаются в самом инкубаторе. Поэтому мне необходимо перенести их из вытяжного шкафа в инкубатор.

Для этого необходимо соблюдать крайнюю осторожность и не наклонять камеры в любом направлении, иначе клеточный раствор может вытечь. В таком случае процедуру придется начать заново. Поскольку клетки находились в камере в инкубаторе в течение одного часа, они теперь прочно прикрепились к поверхности.

На данном этапе я извлек камеру из инкубатора и осторожно перенес её обратно в вытяжной шкаф, соблюдая предельную осторожность, как и в предыдущий раз, чтобы среда не вылилась с мембраны. Теперь необходимо добавить 20 мл среды в растяжимую камеру.

В данном случае я использую специальный состав среды, так как она подвержена контаминации, и этот состав разработан специально для предотвращения загрязнения. Я использую DMEM с добавлением 10% FBS, 1% пенициллина, стрептомицина и дополнительно 1% фунгизона для предотвращения роста грибков. Взяв 20 мл среды, я осторожно добавлю её в растягивающую камеру.

Мы видим, что среда не стекла с самой мембраны, а была добавлена в конец камеры, так что среда сначала проходит под мембраной, а затем распределяется по ее поверхности. Выполняйте это медленно, чтобы не потревожить клетки. Затем снова накройте камеру и плотно зафиксируйте крышку на месте.

На данном этапе вам больше не нужно беспокоиться о том, что вы можете потревожить клетки или вызвать их открепление от мембраны. Поэтому с образцом можно обращаться менее осторожно. Вам необходимо отобрать соответствующее количество штамма.

Принцип работы этого устройства заключается в том, что в нем имеется вращающееся колесо, к которому прикреплен рычаг; длина этого рычага может меняться в зависимости от установленной в центре колеса предварительно изготовленной вставки. Таким образом, при вращении колеса рычаг перемещается вперед и назад, что, в свою очередь, приводит к возвратно-поступательному движению платформы. К этой платформе прикреплены камеры.

Таким образом, они, в свою очередь, также перемещаются вперед и назад. Поэтому, если мне нужно создать деформацию в 5%, я беру заготовку с маркировкой «пять», которая имеет определенную предварительно рассчитанную длину, чтобы этот рычаг переместился в нужное положение. Затем я вставляю её в центр колеса, прикрепляю рычаг, убеждаюсь, что он надежно зафиксирован, и затягиваю соединение с помощью шестигранного ключа для окончательного закрепления.

Когда всё будет установлено, приведено в нулевое положение и зафиксировано, можно будет вставить камеры. Это те самые камеры, которые я только что перенес.

Расположите клетки сверху, осторожно установите их в одно положение и убедитесь, что фиксатор защелкнулся. Убедитесь, что он сдвинут в этом направлении, чтобы зафиксироваться в нулевом положении. Не сдвигайте его до самого конца, иначе вы можете подвергнуть мембрану предварительному натяжению.

Затем зафиксируйте его этим крепежом, чтобы он не смещался. После этого переключите выключатель для запуска. Можно заметить небольшой скачок в самом начале.

Иногда такое случается, движение замирает, но затем обычно всё начинает идти довольно гладко. Теперь все индикаторы движутся вперед и назад, и частота составляет 60 циклов в секунду. Здесь внизу указано 600.

На самом деле здесь должно быть 60,0. Вы также можете изменить частоту по своему желанию. Обычно, после того как клетки подвергаются механическому воздействию в вашей системе, этот процесс продолжается от двух до пяти дней, но при необходимости этот период можно сократить или увеличить.

После завершения эксперимента и достижения определенной конечной точки можно извлечь камеры и использовать клетки на этих мембранах для дальнейших исследований. Обычно мы применяем различные методы, включая микрочипы и 2D-гель-электрофорез. Мы также анализируем экспрессию генов с помощью ПЦР или экспрессию белков с помощью вестерн-блоттинга.

Помимо простого лизиса клеток, вы можете окрашивать их непосредственно на мембране, например, для исследования иммунофлуоресценции определенных белков, или даже отделять клетки от мембраны с последующим окрашиванием и анализом на проточной цитофлуориметре. Таким образом, существует множество различных подходов и параметров, которые можно изучать. Разумеется, возможны и модификации самого устройства, если вам потребуется использовать другие типы микропаттернированных мембран, иные материалы или покрытия — существует множество способов оптимизировать эту систему.