Механическое раздражение Стволовые клетки Использование Циклические одноосной деформации

Привет, меня зовут Сонг Ли. Я доцент кафедры биоинженерии в Университете Калифорнии, Беркли. А я Кайль Капински. Я аспирант по биоинженерии в Университете Калифорнии, Беркли.

И сегодня мы собираемся представить протокол для механической стимуляции стволовых клеток с использованием циклического одноосевого утяжеления. Исследования в нашей лаборатории сосредоточены на клеточной и тканевой инженерии, особенно в сердечно-сосудистой системе. И мы заинтересованы в механической биологии стволовых клеток, потому что есть несколько потенциальных приложений.

Одна из них заключается в том, что мы хотим понять влияние механических факторов на развитие, например, эмбрионального развития. И второе, мы заинтересованы в контроле дифференциации стволовых клеток in vitro или в культуре кишечника. И третье, мы заинтересованы в том, как стволовые клетки реагируют на сердечно-сосудистые механические факторы in vivo, например, после трансплантации.

Так чтобы исследовать все эти вещи, у нас есть пользовательский проектированный биореактор, в котором мы можем высеивать клетки на упругие мембраны, а затем растягивать эти мембраны на определенное время, определенную деформацию и определенную скорость деформации. И теперь мы собираемся провести вас через все процессы, которые вам нужно сделать, чтобы настроить этот протокол. Используя немного лабораторного мыла, любой моющий средство подойдет, наносите моющее средство на обе стороны мембраны и хорошо протрете, чтобы удалить любые частички загрязнений, которые могут мешать клеткам.

И я просто делаю это вручную. Затем, когда я считаю, что я хорошо очищаю обе стороны, я промываю его водой еще раз. И отсюда я хочу убедиться, что он действительно стерильный, и я удаляю любые микрочастицы.

Так что я возьму эту мембрану и положу ее в колбу с 70%-ным спиртом. И просто оставлю это всей длины. И отсюда вы можете взять всю колбу и поставить в ультразвуковой аппарат и оставить ее ультразвуковую обработку на 10 минут.

Теперь, когда у нас есть микропаттерная мембрана в квадратной чашечке, мы хотим убедиться, что сторона с узорами действительно смотрит на нас. Так что я возьму распылитель с спиртом и просто опрыску верхнюю сторону этой мембраны. И теперь вы можете видеть, что жидкость скатывается вниз, и вы видите эти желобки.

Так что это подтверждает, что сторона с узорами смотрит вверх, и у нас она в правильной ориентации. Итак, мы провели ночную УФ-обработку, и вы можете видеть все камеры и все рамки для камер и самих мембран, которые находятся в куполе, и они пролежали в куполе под УФ-излучением всю ночь. И это наш последний этап стерилизации.

Теперь я хочу плазменно обработать все мембраны, и я возьму одну или две мембраны за раз и поместю их в стерильные чашечки и доставлю их в плазменную машину. Теперь вакуумное давление ослаблено, я могу удалить камеру. И снова, это не полностью стерильно, но я снова это сделаю позже.

Так что работая относительно быстро, чтобы плазма оставалась на месте, вам нужно использовать форцепс. И снова это очень важно. Убедитесь, что вы не опрокидываете мембрану или не меняете ориентацию.

Сейчас только верхняя поверхность была плазменно обработана, и я собираюсь положить ее обратно в мою относительно стерильную чашечку плазменной стороной вверх, накрыть крышкой и затем перенести ее в купол. Теперь, когда мембрана была плазменно обработана, я собираюсь положить ее обратно в купол и обработать ее 2% желатином. И это вес в объеме.

Вы можете видеть, что раствор все еще движется в линию с узорами. И он также очень гидрофильный, потому что он был плазменно обработан. Так что раствор распространяется вместо того, чтобы скатываться, если вы случайно перевернете мембрану вверх лицевой стороной, раствор будет вверху, и вы поймете, что делаете неправильно.

Так что убедитесь, что раствор распространяется равномерно. Затем, когда вы сделаете это для всех ваших мембран, просто закройте купол и включите УФ-обработку на 30 минут. Так что в этот момент мембрана была в УФ с желатином на поверхности в течение получаса, и это достаточно, чтобы желатин был абсорбирован на поверхность.

Теперь я хочу промыть мембрану дважды стерильно приготовленным PBS, и я обычно кладу около 10 миллилитров в квадратную чашку и просто промываю рукой, чтобы попытаться не касаться поверхности мембраны, а затем аспирирую PBS. Я собираюсь сделать это еще раз, и после второго раза я оставлю мембрану в PBS, что помогает смазать мембрану, что облегчает ее сборку в камеру. Если оставить сухую мембрану, есть большая вероятность, что она разорвется или как-то повредится.

Это второе промывание. Аспирируйте