Микрофлюидных устройство для воссоздания микроокружение опухоли

Общая цель данной процедуры — продемонстрировать изготовление и работу микрофлюидного устройства, которое воссоздает микроокружение опухоли in vitro и может быть использовано для тестирования химиотерапевтических препаратов. Это микрофлюидное устройство. Данный прибор может быть полезен в следующих областях: упрощенное тестирование химиотерапевтических препаратов in vitro.

Данный метод обеспечивает стабильные и точные результаты при тестировании трехмерных опухолевых тканей, а само устройство позволяет очень точно воспроизвести условия опухоли in vivo. Опухоли существуют в трехмерном микроокружении, поэтому возможность проведения тестов в таких условиях имеет большое значение. Первым этапом процедуры является сборка устройства, которая включает изготовление микрофлюидного чипа с помощью мягкой литографии, пробивание отверстий в точках входа и выхода, приклеивание к предметному стеклу и подключение трубок для подачи и отвода потока.

Затем методом «висячей капли» создаются однородные многоклеточные опухолевые сфероиды для использования в устройстве. После этого сфероиды вводятся в устройство, затем добавляются индукторы апоптоза, детектирующие агенты и химиотерапевтические препараты. В завершение проводится таймлапс-микроскопия с последующим математическим расчетом коэффициентов диффузии лекарственных средств для количественной оценки проникающей способности химиотерапевтического агента.

В конечном итоге, с помощью флуоресцентной микроскопии в режиме таймлапс можно получить результаты, демонстрирующие рост ткани в устройстве, формирование гетерогенных микроокружений внутри ткани и диффузию лекарственного препарата в ткань. Ограниченное проникновение противоопухолевых препаратов в солидные опухоли является одной из основных причин их неэффективности. Большинство современных моделей тестирования противоопухолевых препаратов не имитируют трехмерную структуру солидных опухолей.

Нами было разработано микрофлюидное устройство, состоящее из непрерывно перфузируемых трехмерных опухолевых тканей. Эта модель более точно отражает доставку лекарственных средств в солидные опухоли и их системный клиренс. Многоклеточные опухолевые сфероиды являются общепризнанной моделью трехмерных опухолевых тканей.

В данной процедуре используется метод «висячей капли» для создания сфероидов, предназначенных для использования в микрофлюидном устройстве. Этот метод позволяет формировать однородные сфероиды за короткий промежуток времени. Тестирование химиотерапевтических препаратов in vitro на трехмерных тканях позволяет проводить скрининг лекарственных средств более эффективно по сравнению с использованием клеточных монослоев.

Смешайте ПДМС и отвердитель из силиконового эластомера в массовом соотношении девять к одному. Затем вылейте эту смесь на мастер-форму, чтобы создать слой толщиной 4 мм. Для удаления пузырьков воздуха проведите дегазацию, затем отверждайте при 60 °C в течение пяти часов.

Отделите отвержденный PDMS от формы, чтобы получить штамп с микрофлюидными элементами на эластомере. Затем, используя биопсийный панч диаметром 1,5 мм, установленный на дрель, проделайте отверстия для входов и выходов. Удалите весь образовавшийся мусор.

Обработайте рабочую сторону штампа и чистый предметное стекло кислородной плазмой в течение восьми минут. В установке для плазменного травления в кислороде немедленно соедините обработанные поверхности для создания связи между ними. Выдерживайте сборку при температуре 60 °C на подогревателе предметных стекол в течение не менее пяти часов.

Для усиления соединения подсоедините ПТФЭ-трубки с внутренним диаметром 0,032 дюйма к входным и выходным отверстиям микрофлюидного устройства. Для этого используется интерфейс из разъемов Luer Lock «папа», присоединенных к разъемам Luer Lock «мама» с насечкой; данные соединители позволяют легко продевать трубки, не повреждая их. В завершение соберите систему подачи потока, используя запорные клапаны и Y-образный соединитель, и установите устройство на микроскоп. После установки устройства подсоедините трубки к соответствующим входам и выходам для завершения настройки системы потока.

Как показано на этом рисунке, такая конфигурация обеспечивает простоту и универсальность помещения сфероида в устройство или создания потока среды через устройство для его закрепления. Откройте впускной клапан для упаковки VPN и выпускной клапан для упаковки VP out. Сфероид опухоли может пройти через впускное отверстие и попасть в камеру культивирования, где закрепляющий элемент в этой камере удержит опухоль на месте при потоке среды.

Закройте запорные клапаны и откройте впускной клапан потока VF in и выпускной клапан потока VF out для инициации формирования однородного PHE. Используя метод висячей капли, обработайте клетки trypsinem в культуральном боксе. Извлеките полученные клетки из центрифуги.

Разведите стоковый раствор до нужной концентрации, руководствуясь таблицей 1. Затем снимите крышку 48-луночного планшета и положите её перевернутой стороной вверх. В стерильном боксе наполните каждую лунку планшета одним миллилитром стерильной воды.

Для поддержания влажности поместите каплю разбавленного клеточного раствора объемом 20 µL в каждую круглую область на крышке. С помощью микропипетки осторожно переверните крышку и накройте ею планшет, следя за тем, чтобы капли не касались краев лунок. Инкубируйте планшет при температуре 37 °C.

Ознакомьтесь с таблицей 1, чтобы определить время инкубации в зависимости от используемого типа клеток; в каждой висячей капле будет сформирован стероид. Начните со стерилизации устройства, промыв его 70% ethanol через входной канал. Затем последовательно промойте устройство PBS, а после — HEPES-буферизированной средой для культивирования клеток.

Оставьте шприц со средой, подсоедините его к трубке. Затем наберите в шприц от двух до трех стероидов. Чтобы удалить пузырьки воздуха, подсоедините шприц к входному отверстию для упаковки устройства.

Откройте впускной клапан VPN и закройте VFN, откройте выпускной клапан VP и закройте VF out. Держите шприц с наполнителем вертикально иглой вниз. Дождитесь, пока стероид осядет на дно шприца, в соединитель Luer Lock иглы.

Нажмите на поршень шприца для заполнения и проследите, как PHE поступает в трубку и течет в устройство, так как открыт только выпускной клапан заполнения. Стерид попадет в камеру устройства и задержится стойками в задней части. Оказавшись внутри камеры, S-сфероид примет форму камеры и приобретет прямоугольную геометрию.

Закройте впускной клапан VPN и выпускной клапан VP out, затем установите шприц с раствором SF на шприцевой насос. Управление насосом осуществляется с компьютера с помощью программы Syringe Pump Pro. Откройте впускной клапан VFN и выпускной клапан VF out. Начните подачу среды в устройство со скоростью 3 µL/min.

После инкубации сфероида в течение 24 часов вводят агенты для детекции апоптоза. Перед введением детектирующих или терапевтических агентов дайте сфероиду прийти в равновесие в течение периода до 24 часов для установления градиентов питательных веществ и формирования микроокружения. Затем закройте клапан VFN.

Остановите шприцевой насос. Извлеките шприц из насоса и замените его шприцем, содержащим среду с 0,25 мкл/мл маркера активной каспазы 3 CASPglow red. Промойте устройство этим раствором, вручную пропустив через него 0,7 мл жидкости.

Затем установите шприц в насос. Возобновите поток и откройте клапан VFN. В течение пяти-восьми часов агент для детектирования апоптоза (CasGlove Red Active CPH phase three) диффундирует в ткань и будет флуоресцировать ярче в областях апоптоза. Данная концентрация агента для детектирования апоптоза поддерживается во всех последующих потоковых растворах.

Доксорубицин вводят через пять-восемь часов после введения агентов для детекции апоптоза. После завершения обработки препарат вымывают из системы. Для добавления химиотерапевтических агентов следуйте процедуре детекции апоптоза, чтобы ввести 10 µM гидрохлорида доксорубицина.

Затем замените шприц с препаратом на шприц с 0.7 milliliters среды. Продолжайте подачу терапевтического агента в течение фиксированного периода времени. После этого закройте клапан VFN и выключите шприцевой насос.

Снимите шприц с препаратом со шприцевого насоса и замените его шприцем, содержащим 0,7 milliliters среды. Обеспечьте подачу свежей среды в течение 24–36 часов, непрерывно наблюдая за тканью под микроскопом. Весь процесс сбора данных для таймлапс-микроскопии был автоматизирован с помощью специально написанного скрипта в IP lab; каждые 30 минут проводился захват изображений ПАКС-фоида в проходящем свете и в флуоресценции при 10-кратном увеличении. Для математической оценки коэффициентов диффузии препарата первым шагом является построение средних линейных профилей интенсивности флуоресценции с помощью ImageJ. Выберите прямоугольную область интереса (ROI), охватывающую ткань в камере.

Используйте команду построения профиля (plot profile) для создания профиля средних интенсивностей в зависимости от расстояния от проточного канала. Повторите процедуру для трех различных временных точек. Затем вычтите среднюю интенсивность фоновой флуоресценции из полученных профилей интенсивности и нормализуйте каждый профиль, используя соответствующую максимальную интенсивность, чтобы получить C как функцию от X и T. Где C — нормализованная концентрация доксорубицина; значение C варьируется от нуля до единицы.

Следующим шагом является оценка эффективного коэффициента диффузии доксорубицина в опухолевой ткани. Диффузия может быть представлена следующим уравнением, где ERFC — дополнительная функция ошибок. X — расстояние от канала вглубь ткани, а T — время после введения доксорубицина.

Используйте следующую итерационную схему для каждой рассматриваемой временной точки. Примите предварительное значение D. Вычислите правую часть уравнения в каждой точке X. Рассчитайте сумму квадратов ошибок между обеими частями уравнения, затем измените D так, чтобы минимизировать средний остаток.

Оптимальные значения D, полученные в каждой временной точке, используются для оценки среднего эффективного коэффициента диффузии доксорубицина в ткани. Микрофлюидные устройства содержали оптически доступные культуральные камеры размером 1 мм на 0,3 мм на 0,15 мм для выращивания трехмерной опухолевой ткани. Метод висячей капли позволил быстро формировать опухолевые PHE одинакового размера и формы из нескольких клеточных линий.

PHE успешно выращивали на устройстве в течение трех дней. Рост в камерах сопровождался воспроизводимым изменением микроокружения. В пределах PHE апоптоз реже происходил в клетках, расположенных в непосредственной близости от канала потока, и чаще — в более верхних и глубоких слоях ткани.

Устройство использовалось для оценки коэффициента диффузии доксорубицина в опухолевой ткани. Полученное экспериментальным путем значение совпало со значением, ранее описанным для рака молочной железы у человека. При выполнении данной процедуры важно соблюдать особую осторожность для поддержания стерильности при подаче PHE в устройство, так как этот этап проводится вне условий культивирования клеток.

Обильно обрызгайте шприцы и концы трубок этанолом, чтобы обеспечить стерильность. После просмотра этого видео вы должны получить представление о роли ограниченного проникновения лекарственных препаратов в опухоли. Мы продемонстрировали методику имитации доставки и системного клиренса препаратов в трехмерных опухолевых тканях и количественной оценки их проникновения.

Исключение препаратов с плохой проникающей способностью значительно оптимизирует процесс разработки противоопухолевых лекарственных средств.