Микрофлюидных устройство для воссоздания микроокружение опухоли В Vitro

Общая цель этой процедуры — продемонстрировать изготовление и работу микрофлюидного устройства, которое воссоздает микроокружение опухоли in vitro и может быть использовано для тестирования химиотерапевтических препаратов. Это микрофлюидное устройство. Этот прибор может быть полезен в следующих областях, легких для тестирования на химиотерапевтические препараты in vitro.

Он обеспечивает последовательные и точные результаты для тестирования трехмерной опухолевой ткани, и это устройство обеспечивает очень точное представление опухоли in vivo. Опухоли микроокружения существуют в 3D-микроокружениях, и возможность тестирования в одном из них значительна. Первым этапом процедуры является сборка устройства, которая включает в себя изготовление микрофлюидного чипа с использованием мягкой литографии, пробивание отверстий на входах и выходах, прикрепление к стеклянному предметному стеклу и соединение трубок для входа и выхода потока.

Далее генерируются однородные многоклеточные опухолевые стероиды для использования в аппарате методом висячих капель. Затем сфероиды вводятся в устройство, после чего следуют апоптоз, детектирующие агенты и химиотерапевтические препараты. Наконец, проводится покадровая микроскопия с последующей математической оценкой коэффициентов диффузии препарата для количественной оценки проникающей способности химиотерапевтического средства.

В конечном счете, могут быть получены результаты, которые показывают рост тканей в устройстве, образование гетерогенных микросред внутри ткани и диффузию лекарственного препарата в ткань с помощью покадровой флуоресцентной микроскопии. Ограниченное проникновение противораковых препаратов в солидные опухоли является важной причиной их неэффективности. Большинство современных моделей тестирования лекарств от рака не имитируют трехмерную природу солидных опухолей.

Мы разработали микрофлюидное устройство, состоящее из непрерывно перфузированных трехмерных тканей опухоли. Эта модель более точно представляет доставку лекарств к солидным опухолям и их системный клиренс. Многоклеточные опухолевые стероиды являются хорошо зарекомендовавшей себя моделью трехмерных опухолевых тканей.

В этой процедуре используется метод висячих капель для создания стероидов для использования в микрофлюидном устройстве. Этот метод позволяет формировать последовательные стероиды за короткий промежуток времени. Тестирование химиотерапевтических препаратов in vitro в трехмерной ткани может помочь провести скрининг лекарств более эффективным способом по сравнению с монослоями клеток.

Смешайте PDMS и отвердитель из кремниевого эластомера в соотношении девять к одному по весу. Затем вылейте эту смесь на мастер, чтобы образовался четырехмиллиметровый блик Дега. Для удаления пузырьков воздуха отверждается при температуре 60 градусов Цельсия в течение пяти часов.

Извлеките отвержденный PDMS из формы, чтобы получить штамп характеристик текучести на эластомере. Затем с помощью полуторамиллиметрового пробойника для биопсии, установленного на дрели, проделайте отверстия для входных и выходных отверстий. Вытащите мусор.

Подвергните характерную сторону штампа и чистое стекло подвергните воздействию кислородной плазмы на восемь минут. В аппарате кислородного плазменного травления обработанные поверхности немедленно соприкасаются, чтобы образовалась связь между ними. Поддерживайте сборку при температуре 60 градусов Цельсия на подогревателе слайдов не менее пяти часов.

Для усиления соединения подсоедините трубку из ПТФЭ диаметром 0,032 дюйма к входным и выходным отверстиям микрофлюидного устройства. Используя интерфейс соединителей для фиксации приманки с наружной резьбой, прикрепленных к разъемам блокировки приманки с зазубренными гнездами, эти специальные разъемы используются для того, чтобы легко проходить через них без разрыва. Наконец, настройте проточный узел с помощью запорной арматуры и Y-образного разъема, установите устройство на микроскоп После монтажа устройства подсоедините трубки к соответствующим входным и выходным отверстиям, чтобы завершить настройку потока.

Как показано на этом рисунке, такая конфигурация позволяет упростить и универсальность упаковки сфероида в устройство или создать поток среды через устройство для упаковки. Откройте впускной клапан сальника VPN и выпускной клапан сальника VP для удаления опухоли. Затем OID может проходить через входное отверстие и поступать в камеру для культивирования, где штифт в этой камере будет удерживать опухоль на месте для потока среды.

Закройте уплотнительные клапаны и откройте впускной клапан VF внутрь и выпускной клапан VF наружу, чтобы инициировать образование равномерного PHE. С помощью метода висячих капель трипсин помещают ледяные клетки под культуральный колпак. Возьмите полученные трипсиновые клетки из центрифуги.

Разбавьте исходный раствор до нужной концентрации, обратившись к таблице один. Затем снимите крышку 48-луночной пластины и положите ее вверх дном. В стерилизованной вытяжке наполните каждую лунку тарелки одним миллилитром стерилизованной воды.

Для поддержания влажности нанесите на крышку каплю разбавленного клеточного раствора по 20 микролитров в каждую круглую область. С помощью микропипетки осторожно переверните крышку и поместите ее на пластину, следя за тем, чтобы капли не касались краев лунок. Инкубируйте тарелку при температуре 37 градусов по Цельсию.

Обратитесь к таблице 1 для определения продолжительности инкубации в зависимости от конкретной используемой клетки, стероид будет образовываться в каждой висящей капле. Начните со стерилизации устройства путем промывки его 70%-ным этанолом через входное отверстие. Затем промойте каждую из PBS, затем буферизованную среду для культивирования клеток H-E-P-E-S.

Оставьте средний шприц, приложите к трубке. Далее наберите два-три стероида в шприц-кран. Чтобы удалить пузырьки воздуха, приложите шприц к упаковочному отверстию устройства.

Откройте впускной клапан VPN и закройте VFN, откройте выпускной клапан VP и закройте VF наружу. Держите упаковочный шприц вертикально иглой вниз. Наблюдайте, как стероид оседает на дно шприца в соединитель замка приманки иглы.

Нажмите на поршень упаковочного шприца и наблюдайте, как PHE входит в трубку и поступает в устройство, потому что открыт только выпускной клапан сальника. Стероид будет входить в камеру устройства и удерживаться стойками сзади. Попадая внутрь камеры, сфероид S приспосабливается к форме камеры и приобретает прямоугольную геометрию.

Закройте впускной клапан VPN и выпускной клапан VP наружу, установите проточный шприц SF на шприцевой насос. Этот насос управляется компьютером с помощью шприцевого насоса с открытым впускным клапаном VFN и выпускным клапаном VF наружу. Начните подачу среды в прибор с трех микролитров в минуту.

После инкубации сфероида в течение 24 часов следует введение агентов, детектирующих апоптоз. Перед введением апоптоза, детектирующих или терапевтических агентов дайте равновесию сфероида на срок до 24 часов для создания градиентов питательных веществ и микроокружения. Затем запорный клапан VFN.

Остановите работу шприцевого насоса. Извлеките шприц из помпы и замените его шприцем, содержащим среду с 0,25 микролитрами на мил CASP светящегося красного активного каспазы тремя маркерами. Промойте прибор раствором, вручную промыв 0,7 миллилитра его через устройство.

Затем установите шприц на помпу. Снова запустите поток и откройте клапан VFN. В течение пяти-восьми часов перчатка бочковой красной активной фазы cph третьей фазы будет диффундировать в ткани и флуоресцировать ярче в апоптотических областях.

Доксорубицин вводится через пять-восемь часов после введения средств, детектирующих апоптоз. Эта обработка выводится из системы путем промывки. Для добавления химиотерапевтических средств следует следовать процедуре выявления апоптоза для введения 10 микромолярного доксорубицина гидрохлорида.

Затем замените лечебный шприц на шприц с 0,7 миллилитрами среды. Продолжайте подачу лечебного средства в течение фиксированного периода времени. Затем перекрыть вентиль VFN и выключить шприцевой насос.

Извлеките лечебный шприц из шприцевого насоса и замените шприц 0,7 миллилитрами среды. Дайте потоку свежей среды в течение 24-36 часов, непрерывно контролируя ткань под микроскопом. Весь процесс сбора данных для покадровой микроскопии был автоматизирован с использованием специального сценария в лаборатории IP, получение изображений проходящего света и флуоресценции PAX Foid при 10-кратном увеличении каждые 30 минут Для математической оценки коэффициентов диффузии лекарственного препарата первым шагом является создание профилей средней линейной интенсивности флуоресценции docs с использованием изображения J. Выберите прямоугольную область интересов, или ROI, охватывающий ткань в камере.

Команда "Построить профиль" используется для создания профиля средней интенсивности в зависимости от расстояния от канала потока. Повторите до трех разных временных точек. Затем вычтите среднюю фоновую интенсивность флуоресценции из полученных профилей интенсивности и нормализуйте каждый профиль с использованием соответствующей максимальной интенсивности, чтобы получить C как функцию X и T. Где C — нормализованная концентрация доксорубицина, значение C изменяется от нуля до единицы.

Следующим шагом является оценка эффективного коэффициента диффузии docs в опухолевой ткани. Диффузию можно представить следующим уравнением, где ERFC — комплементарная функция ошибки. X – расстояние в ткани от канала, а T – время после введения доксорубицина.

Используйте следующую итерационную схему в каждый рассматриваемый момент времени. Угадайте значение для D.Вычислите правую часть уравнения в каждом местоположении. X.Вычислите сумму квадратов ошибок между двумя сторонами, измените D, чтобы свести к минимуму среднее значение остаточного значения.

Оптимальные значения D получены в каждый момент времени для оценки среднего эффективного коэффициента диффузии доксорубицина в ткани. Микрофлюидные устройства представляют собой оптически доступные культуральные камеры размером один миллиметр на 0,3 миллиметра на 0,15 миллиметра для роста трехмерной опухолевой ткани. Метод висячих капель позволил быстро сформировать опухолевую ПГЭ постоянного размера и формы из нескольких клеточных линий.

PHE успешно выращивались на устройстве до трех дней. Рост в камерах был связан с воспроизводимой модификацией микроокружений. При PHE апоптоз происходил реже в клетках, расположенных в непосредственной близости от проточного канала, и выше и глубже в ткани.

Прибор был использован для оценки коэффициента диффузии доксорубицина и опухолевой ткани. Экспериментально полученное значение согласуется со значением, о котором сообщалось ранее при раке молочной железы человека при попытке проведения этой процедуры. Важно проявлять особую осторожность в отношении поддержания стерильности при введении PHE в устройство, поскольку это должно быть выполнено вне клеточной культуры.

Капот щедро распылите этанолом на шприцы и концы трубок, чтобы обеспечить стерильность. После просмотра этого видео у вас должно сложиться понимание роли ограниченного проникновения лекарственных препаратов в опухоли. Мы продемонстрировали технику имитации доставки и системного клиренса лекарств на трехмерных опухолевых тканях и количественной оценки их проникновения.

Исключение плохо проникающих препаратов значительно упростит процесс разработки лекарств от рака.