Hyperinsulinemic-Euglycemic зажим в Сознавая Крыса

Общая цель данной процедуры заключается в оценке чувствительности к инсулину у крысы в сознании без ограничений в движении. Для этого сначала проводят катетеризацию левой сонной артерии. Затем катетеризируют правую яремную вену для обеспечения оптимальных результатов.

Катетеры промывают ежедневно для поддержания их проходимости в течение пятидневного послеоперационного периода восстановления. В конечном итоге с помощью гиперinsulinemic-euglycemic clamp можно получить результаты, отражающие скорость инфузии глюкозы во все тело. Основным преимуществом данной методики является возможность прямого измерения скорости утилизации глюкозы всем организмом при высоких физиологических уровнях инсулина.

Артериальные и венозные катетеры должны быть подготовлены до начала хирургической процедуры. Катетеры должны иметь затупленные концы, быть заполнены гепаринизированным физиологическим раствором и стерилизованы этанолом; фиксирующий жгут должен быть надежно закреплен на расстоянии 2,7 или 3,2 сантиметра от одного из концов для артериальных и венозных катетеров соответственно. В данной процедуре используются взрослые самцы крыс линии Spray SD массой примерно 300 граммов.

Запишите начальную массу животного и используйте этот показатель для мониторинга прибавки массы после операции. Работу следует проводить в асептической операционной зоне. Проведите анестезию крысы 3% изофлураном, поместив ее в анестезиологический бокс.

Переместите животное из зоны проведения операции и подготовьте место разреза, удалив шерсть вокруг шеи и плеч. После удаления шерсти поместите животное в носовой конус для поддержания анестезии с использованием примерно 2% изофлурана. Надежно зафиксируйте животное на операционном столе.

Убедитесь, что крыса полностью анестезирована, проверив наличие рефлексов стопы и/или глаза. Очистите место разреза 70% ethanol, затем обработайте его раствором Betadine и снова 70% ethanol. Первым этапом процедуры является выполнение небольшого вертикального срединного разреза на 10 millimeter выше грудины.

Используйте изогнутый микродиссекционный пинцет для тупого расслоения тканей, чтобы обнажить левую грудинно-сосцевидную мышцу. Отодвиньте эту мышцу, чтобы открыть примерно один сантиметр левой сонной артерии. Поместите микродиссекционный пинцет под сонную артерию, чтобы зафиксировать ее, осторожно отделяя соединительную ткань.

Важно изолировать блуждающий нерв от артерии, не повредив ни саму артерию, ни нерв. Используйте стерильный шелковый шовный материал 4-0 для лигирования цефалического конца. Зажмите сосуд зазубренным микродиссекционным пинцетом.

Проколите перевязанное место. Используйте многоразовый адаптер для забора проб с иглой 21 G. Извлеките стальную пробку из катетера и с помощью стерильного проводника введите катетер в артерию.

Используйте пинцет, чтобы убедиться, что катетер надежно зафиксирован. Частично отпустите микродиссекционный пинцет, зажимая артерию, и продолжайте вводить катетер до самого бусины. На этом этапе кончик катетера должен находиться в дуге аорты.

Закрепите две лигатуры ниже бусины и одну выше, затем промойте линию гепаринизированным физиологическим раствором в концентрации 10 единиц на миллилитр. Чтобы подтвердить работоспособность катетера для забора проб, снова закройте внешний конец катетера пробкой из нержавеющей стали. Затем проведите тупую диссекцию тканей для обнажения правой наружной яремной вены, аккуратно изолируйте вену и перевяжите головную вену.

Завершите процедуру, наложив шов шелковой нитью. Проколите вену иглой 21 G. Извлеките адаптер для забора мультиобразцов.

Извлеките заглушку из нержавеющей стали из катетера и с помощью стерильного проводника для катетера введите его до бусины. Зафиксируйте двумя швами ниже бусины и одним швом выше нее. Затем промойте линию физиологическим раствором с гепарином в концентрации 10 единиц на миллилитр.

Чтобы подтвердить работоспособность катетера, снова закройте его внешний конец стальной пробкой, используя тупоконечную иглу 14 G; проведите иглу под кожей и сделайте разрез на спине между лопатками. Затем проденьте катетеры через иглу так, чтобы они выходили из спины крысы. Должно быть видно примерно четыре сантиметра каждого катетера.

Отрежьте фрагмент медицинского трубки Tigon S 50 HL длиной 0,5 сантиметра и наложите его вокруг обоих экстернализированных катетеров. Зафиксируйте синей лентой для вен и красной для артерий. Повторно проверьте катетеры на проходимость, затем промойте и заполните их гепаринизированным физиологическим раствором в концентрации 150 единиц на миллилитр для предотвращения свертывания крови.

Закройте все разрезы швом из шелковой нити 3-0. Поместите крысу в положение на животе в предварительно прогретую чистую клетку с легкодоступным кормом. Как только крыса полностью восстановит двигательную активность и бдительность, верните ее в домашнюю клетку.

Дайте крысе восстановиться в течение трех-пяти дней, ежедневно контролируя наличие инфекции, болевой синдром и изменение массы тела. Важно поддерживать проходимость катетера на протяжении всего исследования. Каждый день после операции наполняйте шприцы с коническим носиком объемом 1 мл гепаринизированным физиологическим раствором в концентрации 150 единиц на мл и закрывайте их тупой иглой 22G.

Тупоконечную иглу вставляют в трубку из ПЭ 50 длиной 20 сантиметров, на другом конце которой установлен соединитель из нержавеющей стали калибра 23G. Убедитесь, что из системы удалены все пузырьки воздуха. Пережмите артериальную линию, выведенную из крысы, с помощью гемостатических зажимов непосредственно ниже места введения заглушки.

Извлеките стальную пробку катетера с помощью другого зажима. Вставьте соединитель трубки, подключенный к шприцу, в артериальную линию и снимите зажимы, перекрывающие выведенный наружу артериальный катетер. Затем аспирируйте артериальную кровь из катетера в шприц.

Если раствор не всасывается легко, может потребоваться очень осторожно ввести небольшое количество раствора через катетер, чтобы высвободить его кончик. После этого катетер считается проходимым. Когда кровь достигнет шприца, пережмите трубку P 50 рядом со шприцем объемом 1 мл и утилизируйте шприц.

Замените шприц на новый, заполненный свежим физиологическим раствором с гепарином, охлажденным на льду. Откройте зажим трубки и, удерживая новый шприц вертикально, постучите по нему, чтобы пузырьки воздуха поднялись вверх и удалились от линии. Введите гепаринизированный физраствор до тех пор, пока катетерная линия не станет чистой и свободной от крови.

Пережмите артериальную линию сразу под соединителем трубок. Снимите разъем шприца с линии артериального катетера и замените его заглушкой для трубок из нержавеющей стали. Снимите гемостаты, пережимающие выведенный наружу артериальный катетер.

Повторите эту процедуру для венозной линии. Из-за низкого венозного давления отбор проб может быть невозможен. В целом, если гепаринизированный физиологический раствор вводится с минимальным сопротивлением, это свидетельствует о правильном расположении катетера в вене.

Перед началом процедуры необходимо взвесить животных, приготовить растворы и собрать зажимное устройство. После взвешивания животного и подтверждения проходимости катетера поместите его в небольшой контейнер с подстилкой, которая ограничивает, но не препятствует движению. Крысы, используемые в данном исследовании, подвергались голоданию в течение как минимум пяти часов и соответствовали требованиям по послеоперационному набору веса. Вес крысы определяет необходимое в данном случае количество инсулина.

Препарат в дозе 4 mU/kg/min вводится со скоростью 2 µL/min. Приготовьте 50% раствор декстрозы и убедитесь, что объемов обоих растворов достаточно примерно на два часа; используйте шприцы объемом 3 мл. Теперь можно приступать к сборке зажимного устройства.

Подготовьте линии и инфузионные насосы, как показано здесь. Установите шприцы с глюкозой и инсулином в шприцевой насос. Пережмите линии и дайте крысе отдохнуть в течение 30 минут перед началом эксперимента.

Для начала процедуры возьмите базовый образец инсулина и гематокрита; измерение гематокрита позволяет контролировать поддержание объема крови на протяжении всего эксперимента. Как правило, уровень гематокрита не должен снижаться более чем на 10% от исходного значения. Возьмите базовый образец глюкозы и определите уровень глюкозы для проведения гипергликемического зажима (clamp).

Здесь мы поддерживаем уровень гликемии на уровне 5 мМ. После каждого забора крови промывайте артериальную линию небольшим объемом гепаринизированного физиологического раствора (10 единиц на мл) для предотвращения свертывания. После определения целевого уровня глюкозы начните инфузию раствора инсулина.

Измеряйте уровень глюкозы в крови с интервалом от 5 до 10 минут и корректируйте скорость инфузии глюкозы по мере необходимости до достижения стационарного состояния. Как правило, этот процесс осуществляется методом проб и ошибок и может занять от 30 минут до более чем двух часов. Уровень глюкозы, необходимый для поддержания гликемии, зависит от протокола эксперимента.

Для того чтобы состояние считалось стабильным (зафиксированным), три последовательных показателя должны находиться в определенном диапазоне. Если три показания отличаются друг от друга примерно на один миллимоляр, это означает, что уровень глюкозы достиг стационарного состояния. Скорость инфузии глюкозы, необходимая для поддержания гликемии в течение 30 минут; в этот период можно взять как минимум дополнительные пробы крови.

После завершения процедуры клемпа необходимо взять вторую пробу крови для анализа уровня инсулина в плазме и определения гематокрита. Животных можно использовать для дальнейшего тестирования или подвергнуть эвтаназии с последующим сбором тканей для анализа. При правильном выполнении катетерные линии могут оставаться проходимыми от пяти до семи дней, в зависимости от животного.

Метод гиперinsulinemic-euglycemic clamp позволяет измерить чувствительность к инсулину в стационарном состоянии. Важно регистрировать уровни инсулина и глюкозы, а также скорость инфузии глюкозы и показатели гематокрита. Стационарное состояние считается достигнутым, когда уровни глюкозы остаются в пределах одного миллимоля друг от друга в течение 30 минут.

Скорость инфузии глюкозы позволяет определить уровень экзогенной глюкозы, необходимый для поддержания уровня гликемии; по возможности, зависимость скорости от времени следует представить в виде графика, а не в виде единичного среднего значения за определенный период. Следует указывать уровни инсулина как натощак, так и в условиях клэмпа. Эти показатели подтверждают успешное введение инсулина и позволяют выявить любые различия в инсулиновом ответе между группами лечения. Измерение уровня гематокрита в начале исследования и повторно после процедуры гарантирует, что в ходе эксперимента данный показатель снизился не более чем на 5% от исходного уровня после выполнения этой процедуры.

Для оценки утилизации глюкозы всем организмом и отдельными тканями могут быть использованы другие методы, такие как введение изотопных меток.