Микротитровальные Блюдо образование биопленки Пробирной
30 января 2011 г.
Анализ описывает быстрый способ для измерения раннего образования биопленки у бактерий и грибков. Этот метод использует планшет в качестве субстрата для микробной образование биопленки и биопленки визуализируется использованием штамма кристаллический фиолетовый. Препарат обеспечивает либо качественных или количественных тест для раннего образования биопленки.
Общая цель данной процедуры заключается в создании и изучении биопленок в микропланшете. Сначала бактериальная культура вносится в 96-луночный планшет. Затем культуру инкубируют при соответствующей температуре и в течение определенного времени, в зависимости от микроорганизма, для окрашивания биопленки.
В каждую лунку с бактериями добавляют кристаллический фиолетовый, после чего бактерии промывают. В завершение делают фотографии лунок и проводят количественный анализ бактерий. В конечном итоге, путем измерения количества кристаллического фиолетового, можно получить результаты, демонстрирующие накопление и формирование биопленок с течением времени.
Основным преимуществом данного метода является возможность быстрой оценки формирования биопленок бактериальными и грибковыми организмами. Метод также может быть адаптирован для высокопроизводительного генетического скрининга или для поиска новых терапевтических соединений, ингибирующих образование биопленок. Подготовьте пятимиллилитровую ночную культуру дикого типа pseudomonas, aerogen или мутантного штамма.
В среде LB разведите 10 µL культуры в одном мл свежей минимальной среды M 63, дополненной магнием, сульфатом, глюкозой и казином. Затем с помощью пипетки перенесите по 100 µL разведенной культуры в отдельные лунки 96-луночного планшета с круглым дном. Инкубируйте планшет при 37 °C от 4 до 24 часов для роста биопленки.
После формирования биопленок извлеките планшет из инкубатора и удалите супернатанты культур, перевернув планшет и вытряхнув жидкость. Затем осторожно погрузите планшет в небольшую емкость с водой, чтобы смыть оставшиеся несвязанные клетки или компоненты среды, которые могут вызвать фоновое окрашивание. Вытряхните воду, промокните планшет и повторите промывку.
После очистки планшета добавьте в каждую лунку 125 microliters 0.1% раствора кристаллического фиолетового. Для окрашивания клеток инкубируйте планшет при комнатной температуре в течение 10–15 минут.
Затем промойте планшет три или четыре раза, как было показано ранее. После финальной промывки тщательно промокните планшет стопкой бумажных полотенец, чтобы удалить излишки жидкости, переверните его и оставьте сохнуть в перевернутом виде на несколько часов. После высыхания планшета лунки можно сфотографировать на цифровую камеру для оценки качества биопленок.
Как показано здесь, подвижные бактерии, такие как pseudomonas aerogen слева и pseudomonas fluorescence справа, при росте биопленки имеют тенденцию формировать их на границе раздела фаз «воздух-жидкость». Напротив, неподвижные бактерии staphylococcus ora формируют биопленки на дне лунок. Чтобы количественно оценить биопленки, сначала добавьте 125 µL 30% уксусной кислоты в каждую лунку, включая контрольную лунку, содержащую только уксусную кислоту, и инкубируйте планшет при комнатной температуре от 10 до 15 минут, чтобы кристаллический фиолетовый, удерживаемый биопленками, растворился.
Затем перенесите по 125 µL растворенного красителя из каждой лунки в новый 96-луночный микротитр-планшет с плоским дном. С помощью планшетного ридера измерьте оптическую плотность в каждой лунке при длине волны 550 нм. Концентрация кристаллического фиолетового в каждой лунке пропорциональна количеству клеток в биопленке.
На этом графике представлена количественная оценка образования и накопления биопленки *Pseudomonas fluorescence* с течением времени при инкубации при 37 °C. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как проводить анализ биопленки в 96-луночном планшете в сочетании с другими методами, такими как микроскопия. Этот метод может внести значительный вклад в наше понимание процессов формирования биопленок.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном методе описан экспресс-способ измерения ранних стадий формирования биопленок бактерий и грибов с использованием микротитровального планшета. Визуализация биопленки осуществляется путем окрашивания кристаллическим фиолетовым, что позволяет проводить как качественный, так и количественный анализ.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Микробиология
- Исследование биопленок
- Разработка методов анализа
Теоретические основы
- Биопленки представляют собой сообщества микроорганизмов, прикрепляющиеся к поверхностям.
- Изучение формирования биопленок имеет решающее значение для понимания поведения микробов.
- Кристаллический фиолетовый является распространенным красителем, используемым для визуализации биопленок.
- Данный метод позволяет быстро оценить развитие биопленки.
Цель исследования
- Разработка надежного метода анализа раннего формирования биопленки.
- Количественная оценка накопления биопленки с течением времени.
- Облегчение изучения микробных взаимодействий в биопленках.
Используемые методы
- Добавьте бактериальную культуру в 96-луночный микротитр-планшет.
- Инкубируйте культуру при подходящей температуре и в течение необходимого времени.
- Добавьте кристаллический фиолетовый для окрашивания биопленки.
- Промойте лунки и сделайте фотографию для количественной оценки формирования биопленки.
Основные результаты
- Результаты показывают накопление биопленок с течением времени.
- Количественные данные можно получить с помощью измерений с использованием кристаллического фиолетового.
- Данный анализ обеспечивает четкую визуализацию процесса образования биопленки.
Выводы
- Данный метод эффективен для изучения ранних этапов формирования биопленок.
- Он может быть применен к различным видам бактерий и грибов.
- Этот анализ углубляет понимание динамики микробных биопленок.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Анализ формирования биопленок в микротитрационном планшете позволяет проводить бысткую высокопроизводительную оценку развития биопленок на ранних стадиях, что способствует валидации мишеней при поиске антимикробных средств. Благодаря количественному определению накопления биопленки с помощью окрашивания кристаллическим фиолетовым, данный метод предоставляет воспроизводимые количественные данные, которые помогают снизить риски при выборе терапевтических кандидатов, воздействующих на адгезию и персистенцию микроорганизмов. Этот масштабируемый подход применим к бактериальным и грибковым системам, облегчая ранний скрининг соединений, модулирующих образование биопленок.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: Позволяет проверять терапевтические гипотезы путем идентификации генов и факторов, необходимых для инициации биопленок, таких как адгезины, пили и пути c-di-GMP.
- Практическая ценность: Обеспечивает функциональную валидацию мишеней посредством скрининга с потерей функции в микробных штаммах в стандартизированных условиях.
- Прогностическая ценность: Облегчает отбор наиболее перспективных соединений из портфеля, позволяя отличить вещества, ингибирующие раннее формирование биопленки, от неэффективных.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Подготовка валидированных микробных систем для последующего скрининга соединений путем установления воспроизводимых показателей формирования биопленки.
- Практическая ценность: Решение вопроса стандартизации анализа за счет унифицированных этапов инкубации, окрашивания и количественного определения с использованием 96-луночного планшета.
- Масштабируемость: Обеспечение готовности к скринингу и возможность повторного использования платформы для генетического скрининга и работы с библиотеками соединений на различных микробных штаммах.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная значимость: связывает данные о раннем формировании биопленки с профилями фенотипической резистентности, что способствует механистическому снижению рисков при разработке противомикробных препаратов-лидеров.
- Преклиническая преемственность: позволяет принимать обоснованные с учетом рисков решения о дальнейшем продвижении кандидатов, связывая ингибирование биопленок in vitro с толерантностью к антибиотикам и иммунным эффекторам.
- Соответствие биомаркеров: поддерживает разработку трансляционных биомаркеров за счет количественных показателей, коррелирующих с фенотипами толерантности, связанными с биопленками.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный анализ вписывается в непрерывный процесс разработки лекарственных средств — от идентификации мишени до оптимизации соединений-лидеров, что особенно актуально для программ создания противоинфекционных препаратов, нацеленных на борьбу с резистентностью, опосредованной биопленками.
- Открывающая биология: Оказывает поддержку проверке гипотез о путях микробной адгезии и формирования биопленок с помощью генетических и химических воздействий.
- Скрининг: Описывает готовность анализа посредством стандартизированного формирования биопленок и количественного определения с помощью кристаллического фиолетового, что позволяет проводить надежную оценку соединений.
- Аналитика: Акцентирует внимание на количественных измерениях абсорбции при 550 nm, которые позволяют сравнивать биомассу биопленок при различных условиях и для разных штаммов.
- Трансляционные исследования: Связывает ранние данные по ингибированию биопленок с доклинической значимостью путем моделирования механизмов толерантности, наблюдаемых при хронических инфекциях.
- Корпоративное повторное использование: Позиционирует данный метод как многоразовую скрининговую платформу для антимикробных, антигрибковых и антибиопленочных программ на нескольких моделях патогенов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Прогностическая уверенность в валидации мишени за счет измеримого снижения образования биопленок при генетическом или фармакологическом воздействии.
- Операционная ценность: Стандартизация, воспроизводимость и масштабируемость в форматах 96-луночных планшетов для высокопроизводительного анализа.
- Стратегическая ценность: Оптимизация принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) при идентификации ведущих соединений за счет снижения количества ложноположительных результатов с помощью ортогонального количественного анализа биопленок.
- Влияние на портфель: Приоритизация соединений с учетом рисков на основе дозозависимого ингибирования раннего образования биопленок.
Особенности реализации
- Требуются микробиологические навыки работы в стерильных условиях, подготовки культур и манипуляций с биопленками.
- Необходим доступ к планшеточитателям с возможностью измерения абсорбции при 550 nm и стандартным 96-луночным микротитрационным планшетам.
- Требуется межгрупповая стандартизация времени инкубации, этапов промывки и протоколов окрашивания для минимизации вариабельности между лунками.
- При применении метода для немодельных организмов или грибов с иными адгезивными свойствами требуются соответствующие корректировки.
- Существуют практические ограничения, такие как невозможность моделирования архитектуры зрелой биопленки или фенотипов, зависящих от потока, как отмечено в источнике.
