Создание эмбриональных Мышь нейронные культуры стволовых клеток Использование Neurosphere Пробирной

Целью данного видеопротокола является выделение и экспансия нейральных стволовых клеток из эмбрионального мозга мыши с использованием метода нейросферного анализа. Процедура включает получение эмбрионов мыши на стадии E 14 с последующей микродиссекцией мозга для выделения ганглионарных выступов, диссоциацию полученной ткани для получения суспензии единичных клеток и, наконец, посев клеток для нейросферного культивирования. Здравствуйте, я Хассан Али из лаборатории доктора Брента Френнелса в Институте мозга Университета Флориды.

Сегодня я покажу вам, как создать культуру нейросфер из эмбрионального мозга мыши с помощью метода анализа нейросфер. В нашей лаборатории мы регулярно используем этот анализ для изоляции и экспансии нейральных стволовых клеток. Итак, приступим.

Проведите анестезию беременной мыши с установленным сроком спаривания. На 14-й день гестации выполните подвывих шейного позвонка и промойте брюшную полость 70% ethanol. Захватите кожу над брюшной полостью с помощью больших пинцетов, затем разрежьте кожу и подлежащую фасцию большими ножницами.

Для обнажения брюшной полости и рогов матки удалите рога матки с эмбрионами и перенесите их в коническую пробирку объемом 50 ml с холодным HEM. После переноса тканей матки в ламинарный шкаф класса II удалите HEM из пробирки объемом 50 ml и промойте ткани достаточным объемом свежего холодного HEM для удаления таких загрязнений, как кровь и шерсть; повторите процедуру промывки два-три раза. Перенесите ткани матки в чашку Петри диаметром 10 см с холодным HEM.

Раскройте рога матки с помощью маленьких изогнутых пинцетов и ножниц, после чего перенесите эмбрионы в новую чашку с холодным HEM. Повторяйте эту процедуру до тех пор, пока не будут собраны все эмбрионы. Затем поместите эмбрионы под диссекционный микроскоп.

Отделите головы эмбрионов на уровне шейного отдела спинного мозга и перенесите их в другую чашку Петри с холодным HEM. Удерживая голову тонкими изогнутыми пинцетом, используйте микроножницы. Сначала сделайте горизонтальный разрез над носом, затем продолжите разрез по средней линии от лба в сторону затылка.

Убедитесь, что разрез проходит через кожу и череп, не повреждая подлежащие ткани головного мозга. Извлеките мозг из черепной коробки, осторожно проталкивая края разреза назад с помощью изогнутого пинцета. Повторяйте эту процедуру до извлечения мозга из всех черепов.

Плотно удерживайте мозг изогнутым пинцетом так, чтобы дорсальная сторона была обращена вверх, затем с помощью микроножниц разрежьте кору каждого полушария от обонятельных луковиц до задней части полушария. Чтобы обнажить ганглиозные выступы, удерживая мозг неподвижно, выделите весь ганглиозный выступ пинцетом с углом 45 градусов и перенесите его в другую чашку Петри. Здесь четко виден ганглиозный выступ с его медиальной и латеральной частями.

В качестве альтернативы можно выделить ганглионарные выступы, удалив окружающие ткани с помощью тонкого пинцета. Вы также можете разрезать весь выступ на медиальную и латеральную половины, если вас интересует выращивание клеток из любого из этих регионов.

Повторяйте эту процедуру до тех пор, пока все образцы мозга не будут подвергнуты микродиссекции. Используйте 1 ml среды для нейральных стволовых клеток для сбора фрагментов ткани и перенесите их в центрифужную пробирку объемом 15 ml. Дайте комочкам ткани осесть в пробирке объемом 15 ml, чтобы не оставить остатков ткани.

Удалите часть супернатанта и промойте дно чашки Петри, чтобы перенести оставшуюся ткань в пробирку объемом 15 мл. Прижав кончик пипетки к дну пробирки, три или четыре раза прокачайте суспензию вверх-вниз, чтобы измельчить ткань и получить суспензию одиночных клеток.

Затем дайте суспензии отстояться в течение одной минуты, чтобы неассоциированные конгломераты выпали в осадок, и перенесите почти всю клеточную суспензию в другую пробирку объемом 15 мл. Затем добавьте один миллилитр среды для нейральных стволовых клеток к оставшимся конгломератам и диссоциируйте их до состояния одиночных клеток. Соберите содержимое пробирок.

Затем центрифугируйте суспензию при 700 RPM или 110 G в течение пяти минут. Удалите супернатант и ресуспендируйте клетки в одном миллилитре полной среды для нейральных стволовых клеток. Возьмите 10 µL клеточной суспензии и тщательно смешайте с 90 µL трипанового синего.

Затем возьмите 10 µL этой суспензии и перенесите ее в гемоцитометр. Проведите подсчет клеток. Перенесите в общей сложности 20 ml полной среды для нейральных стволовых клеток в коническую пробирку объемом 50 ml для посева в один флакон T 80.

Затем перемешайте суспензию клеток и добавьте необходимое количество клеток для достижения общей плотности 200 000 клеток на миллилитр или 4 миллиона клеток на флакон T 80. Добавьте EGF до конечной концентрации 20 нанограмм на миллилитр. Перемешайте клетки, находящиеся в полной среде для нейральных стволовых клеток, с фактором роста и перенесите клеточную суспензию во флаконы T 80.

Маркируйте колбу и осмотрите клетки под микроскопом, чтобы убедиться в получении суспензии единичных клеток без скоплений ткани. Перенесите колбу в инкубатор при 37 °C с 5% CO2 на пять-семь дней. Через пять-семь дней оцените состояние клеток в колбе под микроскопом.

К этому времени нейросферы уже сформировались, их диаметр должен составлять от 150 до 200 микрон, и они готовы к субкультивированию. Перенесите содержимое флакона в стерильную пробирку для культур тканей подходящего размера, центрифугируйте пробирку и удалите супернатант. Ресуспендируйте сферы в 1 мл предварительно подогретого трипсина и поместите пробирку в водяную баню при температуре 37 °C на две минуты.

Затем добавьте равный объем ингибитора трипсина и аккуратно, но тщательно перемешайте, чтобы остановить активность трипсина. Снова центрифугируйте и удалите супернатант. Затем ресуспендируйте клетки в 1 mL полной среды для нейральных стволовых клеток и проведите подсчет клеток, как было описано ранее. Чтобы засеять один флакон T 175, перенесите в коническую пробирку объемом 50 ml в общей сложности 40 ml полной среды для нейральных стволовых клеток.

Затем перемешайте клетки и добавьте необходимое количество клеток для достижения общей плотности 50 000 клеток на M или 2 миллиона клеток на флакон T 1 75. Затем добавьте EGF до конечной концентрации 20 нг/мл. Перемешайте клетки, находящиеся в полной среде для нейральных стволовых клеток, с фактором роста и перенесите клеточную суспензию во флакон T 1 75.

Маркируйте колбу и перенесите ее в инкубатор на пять-семь дней. Это пример первичной культуры нейральных стволовых клеток E 14. Спустя три дня после посева стрелками показаны пролиферирующие кластеры нейральных стволовых клеток.

Также можно увидеть прикрепленные к субстрату и дифференцированные клетки. Это пример первичной культуры нейральных стволовых клеток эмбриона 14-го дня спустя семь дней после посева. Как видно, присутствуют сферы различных размеров.

Также присутствуют дифференцированные клетки. Количество клеточного детрита значительно ниже, чем в культурах первичных нейросфер взрослых особей. Кроме того, сферы не уплотнены и имеют микровыступы по периферии, что свидетельствует о том, что сферы здоровы и жизнеспособны.

Не следует допускать чрезмерного увеличения размеров сфер, так как из-за гибели клеток в центре они могут потемнеть. Крупные сферы также могут прикрепляться к субстрату и дифференцироваться. На данном примере представлены нейросферы E 14 первого пассажа через пять дней после посева.

Здесь снова видны микровыступы на периферии сфер. Мы только что продемонстрировали вам, как выращивать нейросферы из ганглионарных выступов мыши на стадии E 14, используя те же процедуры, которые описаны здесь. Вы также можете выращивать нейросферы из других областей мозга, таких как кора и средний мозг.

Благодарим за просмотр и желаем успехов в культивировании нейросфер.