Выделение геномной ДНК из хвостов мышей

Это 10-дневный щенок мыши, и я собираюсь сделать биопсию хвоста, а затем извлечь геномную ДНК из его хвоста. Итак, что я собираюсь сделать, это отрезать немного его хвоста, примерно три миллиметра, а затем я поместим кусок хвоста в трубку эйнора и поместим трубку эйнора на сухой лед. Теперь, чтобы избежать загрязнения от одной мыши к другой, я обычно отмечаю лезвие бритвы в той части, где я делал последний разрез.

Таким образом, для следующей мыши я обязательно использую чистый кусок лезвия бритвы для следующей биопсии хвоста. Чтобы различать разных мышей в вашем помете, вам понадобится способ идентификации мышей. Один из способов сделать это — пробить отверстие в ушах с помощью дырокола, показанного здесь.

Аккуратно возьмите мышь за загривок как бы так, переверните ее и зажмите хвост между пальцами. Возьмите прокол ушного отверстия в другой руке и сделайте там быстрый надрез в ухе мыши. Видите, как это было безболезненно?

Итак, теперь вы можете видеть, что у меня есть несколько кусочков хвоста в этих эйноровых трубках, и теперь я собираюсь добавить растворы, которые помогут им перевариться. Сначала я добавлю 720 микролитров раствора STE, а затем добавлю 30 микролитров белка. Эйс K.So вот взгляните на кусок хвоста, который мы отрезали перед пищеварением.

Теперь я собираюсь разместить хвостовые части на нагревательном блоке под углом 55 градусов. Многие протоколы призывают к непрерывному движению, раскачиваясь под углом 55 градусов, но для моих целей это не понадобится, потому что я буду вихревать хвостовые части. Теперь я собираюсь вращать кусок хвоста в течение двух секунд.

Раз, два. Итак, после вортекса, вот что осталось внутри эйноровой трубки, и вы можете видеть, что кусок хвоста был полностью растворен и активирует протеиназу К при 70 градусах Цельсия в течение пяти минут. Тушите на льду в течение пяти минут.

Вращайте хвостовые части в микроцентрифуге в течение 10 минут на полной скорости. В этой микроцентрифуге полная скорость составляет 13 000 об/мин. В то время как пищеварительные хвосты вращаются вниз, наметьте несколько эйноровых трубок, наполните их 750 микролитрами изопропанола.

После вращения переваренных хвостов волосы и непереваренный материал образуют гранулу на дне трубки для сцеживания. Раствор, содержащий переваренный материал, STE и протеиназу К, в пробирку эйнора, содержащую изопропаноловую ДНК, начнет выходить из раствора, будет казаться призрачным и похожим на перо, и тут же вокруг этого пузыря плавает геномная ДНК, которая была выделена из хвоста мыши. После смешивания изопропанола и раствора STE, геномная ДНК выйдет из раствора, и вот этот маленький шарик будет вращаться вниз осажденной геномной ДНК в течение пяти минут на полной скорости в микроцентрифуге.

Там, на дне пробирки, находится взгляд на нашу гранулированную геномную ДНК. Теперь я собираюсь аспирировать раствор внутри пробирки, оставив только гранулу геномной ДНК. Каждый раз, когда я аспирирую очередную трубку, я меняю трубку.

Погладьте кончик на кончике этого аспиратора. После отсасывания STE и изопропанола я добавлю один миллилитр 70% этанола, чтобы промыть гранулу геномной ДНК. Поскольку гранула геномной ДНК обычно прилипает к боковой стороне микрофуговой пробирки и ее трудно снять, чтобы тщательно промыть ее в 70% этаноле, вам придется разгребать ее по штативу для микрофуговых пробирок, который у меня есть.

Вы можете сделать это так. Итак, вот взгляд на геномную ДНК после того, как она была гранулирована и промыта в 70% этаноле. Я собираюсь снова раскрутить его на полной скорости в течение пяти минут, а затем откачать 70% этанола вниз по гранулам геномной ДНК после того, как они будут промыты.

Их 70% этанол пять минут на полной скорости, собирается аспирировать 70% этанол и дать ДНК высохнуть в течение пяти минут. На дне пробирки можно посмотреть на гранулу геномной ДНК, и она настолько сухая, насколько вы хотите ее получить. Итак, я высушил гранулы геномной ДНК из хвостов мышей, и теперь я собираюсь добавить сто микролитров 40 миллимолярного трисса при pH 8.

Итак, у меня есть геномная ДНК при температуре 50 градусов по Цельсию, где она переходит в раствор быстрее, чем при комнатной температуре. Примерно через час или около того при 50 градусах я либо замораживаю его, либо ставлю при четырех градусах, пока не захочу запустить свои ПЦР-реакции, чтобы выяснить, у каких мышей положительный результат на мой трансген.