Органотипической гиппокампа культур фрагмент

Общая цель данной процедуры заключается в культивировании органотипических срезов гиппокампа. Это достигается путем предварительного выделения гиппокампа, после чего выполняется нарезка гиппокампа на срезы.

Третьим этапом процедуры является отделение и сортировка срезов гиппокампа. Заключительным этапом процедуры является культивирование срезов гиппокампа. В итоге можно получить результаты, демонстрирующие жизнеспособность органических срезов гиппокампа при визуализации с помощью диссекционного стереомикроскопа или микроскопа.

Здравствуйте, меня зовут Химена Опиц, я научный сотрудник в лаборатории доктора Андреса Бара в Вашингтонском университете в Сиэтле. Я продемонстрирую процедуру органотипического культивирования срезов гиппокампа. Как правило, специалисты, впервые использующие этот метод, сталкиваются с трудностями из-за необходимости быстрого препарирования и нарезания гиппокампа, а также необходимости предотвращения контаминации, что требует использования стерильного раствора для препарирования и соблюдения условий культивирования срезов.

Среды можно приготовить заранее (до трех недель) и хранить при температуре 4 °C, как описано в письменном протоколе. Перед получением срезов гиппокампа можно подготовить культуры. Необходимо надлежащим образом стерилизовать как ламинарный шкаф для культур тканей, так и оборудование, которое будет использоваться при препарировании.

Сначала протрите внутреннюю поверхность ламинарного шкафа 70% ethanol. Затем поместите диссекционный микроскоп и все инструменты для диссекции внутрь шкафа. Подготовьте устройство для нарезки тканей, застелив предметный столик чистым листом тефлона и установив новое лезвие.

Поместите слайсер для тканей в ламинарный шкаф; используя УФ-лампу, стерилизуйте все поверхности и оборудование в течение 15 минут. Выключите лампу по завершении процесса УФ-стерилизации. Работайте внутри ламинарного шкафа.

Сначала подготовьте шестилуночные планшеты для культивирования срезов гиппокампа. Пипетором внесите 750 µL SEM в каждую лунку шестилуночного планшета. Затем с помощью стерильного пинцета поместите в каждую лунку планшета для культивирования клеток соответствующий вкладыш.

Следите за тем, чтобы под вставкой не образовывались пузырьки воздуха. Важно, чтобы мембрана каждой вставки для культивирования клеток была увлажнена средой для культивирования срезов. Если мембрана сухая, убедитесь в отсутствии пузырьков воздуха.

Если мембрана находится выше уровня мениска SCM, в лунку можно добавить больше среды. Поместите подготовленные культуральные планшеты в инкубатор для культур тканей. Установите температуру 35 °C и концентрацию carbon dioxide 5% до момента использования.

Наконец, наполните ведерко со смесью льда и соли и поместите его рядом с зоной декапитации, работая внутри вытяжного шкафа. Налейте в стакан объемом 100 мл препарирующий раствор. Поместите стакан в смесь льда и соли и продувайте раствор смесью 5% carbon dioxide и 95% oxygen в течение 10–20 минут, пока цвет не изменится с розового на оранжевый.

В результате получается суспензия из замороженного и жидкого диссекционного раствора. Теперь среда для диссекции и планшеты для культивирования тканей готовы к работе. Оберните P3–P7.

Для данной процедуры используют щенков. Культуры срезов можно готовить одновременно из трех щенков. Данная процедура будет продемонстрирована на примере одного щенка.

Быстро извлеките мозг из обезглавленной куколки в коконе и поместите его в стакан объемом 100 milliliter с препарирующим раствором Slurry Chill на одну минуту. В течение этого времени подготовьте чашку для препарирования, добавив около 10 milliliters ледяного препарирующего раствора на дно чашки для культивирования тканей диаметром 60 millimeter. С помощью закругленной ложечки или микрошпателя перенесите мозг из стакана объемом 100 milliliter в чашку диаметром 60 millimeter, наполненную холодным препарирующим раствором. Убедитесь, что мозг полностью покрыт препарирующим раствором.

Поместите чашку с мозгом под диссекционный микроскоп. Найдите мозг, глядя в окуляр микроскопа. С помощью стерильного диссекционного пинцета переместите мозг в центр поля зрения.

Удерживайте мозг по средней линии, прижав его к дну чашки с помощью диссекционных пинцетов. С помощью инструмента для диссекции гиппокампа осторожно отделите полушария коры от среднего мозга, оставляя средний мозг на месте; в идеале, не отделяя полушария коры от остальной части мозга, обнажите гиппокамп. С помощью инструмента для диссекции гиппокампа извлеките гиппокамп из одного полушария.

Затем с помощью диссекционной иглы удалите как можно больше тканей, не относящихся к гиппокампу. После того как первый гиппокамп будет изолирован и очищен, повторите эту процедуру для второго гиппокампа из другого полушария. Далее с помощью стерильных ножниц отсеките кончик наконечника фильтрационного дозатора P 1000.

Установите наконечник на стерильный дозатор P 1000. Осторожно аспирируйте один гиппокамп и перенесите его на тефлоновый лист вибратома. Затем аналогичным образом поместите на вибратом второй гиппокамп.

Поместите половинки гиппокампа вогнутой стороной вверх и расположите их перпендикулярно лезвию, затем удалите излишки жидкости с тефлонового листа. Установите винт или микрометр в нулевое положение. Нарежьте гиппокампы на срезы толщиной 400 µm.

Подготовьте еще один обрезанный фильтр-наконечник для P 1000 и установите его на стерильный дозатор P 1000. Налейте примерно 10 миллилитров охлажденной среды SCM в стерильную чашку для культивирования тканей диаметром 60 миллиметров. С помощью дозатора добавьте немного среды и перенесите срезы гиппокампа из слайсера в чашку.

Стараясь не допустить образования пузырьков воздуха после повторения процесса переноса для всех срезов, поместите чашку под диссекционный микроскоп. В завершение, используя ирисовый шпатель и прямой шпатель, осторожно разделите срезы друг от друга.

Отделите четко очерченные и неповрежденные срезы от поврежденных. Теперь четко очерченные срезы гиппокампа готовы к культивированию. Извлеките из инкубатора предварительно подготовленные шестилуночные планшеты для культивирования тканей, содержащие SCM и вставки для культур клеток; с помощью дозатора P 1000 с обрезанным широким наконечником перенесите по четыре-пять отдельных срезов на каждую мембрану.

При необходимости используйте ирисовый шпатель для разделения срезов. Следите за тем, чтобы срезы не располагались слишком близко к стенке вставки или друг к другу. Осторожно, не касаясь срезов, аспирируйте излишки среды с поверхности клеточной культуры.

Вставьте мембрану. В завершение верните планшет, в котором теперь находятся культуры срезов гиппокампа, в инкубатор для культивирования тканей. Установите температуру 35 °C и концентрацию carbon dioxide 5%.

Через 48 часов извлеките планшет из инкубатора, работая внутри ламинарного шкафа для культур тканей. Аспирируйте среду с помощью пастернаужной пипетки. Добавьте по 750 µL свежей предварительно нагретой SCM в каждую лунку.

Снова убедитесь, что под мембраной вставки для культивирования клеток не образовалось пузырьков. Перед вами пример здорового среза гиппокампа, готового к культивированию. Области гиппокампа — CA1, CA3 и зубчатая извилина — отчетливо видны и не повреждены.

Здесь показан поврежденный срез гиппокампа, который не использовался для культивирования. Наконец, представлен пример здорового среза гиппокампа после четырех дней культивирования. Обратите внимание, что под диссекционным микроскопом срез выглядит белым, а его поверхность чистая.

Области гиппокампа — CA1, CA3 и зубчатая извилина — четко видны и не повреждены. После освоения данной техники ее выполнение при правильном подходе занимает около одного часа.

При выполнении данной процедуры крайне важно помнить о необходимости соблюдения правил стерильности и бережного обращения с тканью. После просмотра этого видео у вас должно сформироваться четкое понимание того, как проводить органотипическое культивирование и лизис гиппокампа.

Спасибо и удачи в ваших экспериментах.