Альтернантных Метод Традиционные НАСА задних конечностей Выгрузка модели у мышей

Общая цель данной процедуры — выполнение разгрузки задних конечностей (hu) у мышей с помощью более простого и доступного метода, который сводит к минимуму стресс для животного. Данный метод фиксации за хвост успешно вызывает атрофию задних конечностей, не нарушая общего состояния здоровья и не приводя к потере массы тела. Первым этапом является имплантация кольца в хвост взрослой мыши.

Важно регистрировать массу тела и данные о состоянии здоровья животных на протяжении всего исследования. Затем собирают аппарат для разгрузки задних конечностей и помещают его в клетку, в которой будет проводиться процедура. После восстановления животного его помещают в аппарат для проведения разгрузки.

В конечном итоге результаты могут быть получены путем измерения массы тела и массы мышц, что позволило выявить мышечную атрофию в задних конечностях мышей в условиях отсутствия нагрузки. Главным преимуществом данной методики перед существующими методами, такими как техника тейпирования по Маори Холтону, является то, что кожа хвоста всегда остается видимой. Мыши не могут выбраться из аппарата для подвешивания или играть с кольцом, а также быстрее восстанавливаются и сохраняют стабильную массу тела.

Данный метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области физиологии опорно-двигательного аппарата, а также гравитационной и космической биологии, например, о том, как предотвратить атрофию скелетных мышц и потерю костной массы после длительных периодов физической неактивности, постельного режима, иммобилизации конечностей, в условиях микрогравитации, при нейромышечных заболеваниях и с возрастом. Эта идея возникла у нас после того, как мы столкнулись с осложнениями при использовании техники тейпирования хвоста по Мори Холдену: мы постоянно теряли животных и экспериментальные данные из-за того, что мыши вырывались из аппарата для фиксации задних конечностей при демонстрации данной методики.

Сегодня со мной Андре Феррара, старший научный сотрудник моей лаборатории. В помощь Андре пришли Жаклин Крисси, докторант нашей лаборатории, и Эндрю Данн, студент бакалавриата, также работающий в лаборатории. Начните со стерилизации области хирургического вмешательства, анестезируйте взрослую мышь с помощью изофлурана, после чего зафиксируйте вес мыши и поместите её на грелку. Подготовьте хвост к операции, обработав его раствором хлоргексидина.

Начните отсчет от конца волосяного покрова тела у основания хвоста, чтобы найти пятый, шестой или седьмой межпозвоночный промежуток между двумя костными выступами на хвосте. Используйте гемостат и иглу 20 5G, чтобы сделать направляющее отверстие между двумя позвонками в межпозвоночное пространство. Извлеките иглу и введите стальную шовную нить.

Отрежьте шовный материал длиной 10 сантиметров, используя отверстие. С каждой стороны хвоста должно выступать по пять сантиметров нити. Прижмите кончик большого пальца к хвосту и свободной рукой обмотайте стальную нить вокруг большого пальца.

Скрутите концы, чтобы сформировать большую петлю. Длина закрученной или кольцевой части должна составлять плюс-минус 3 мм. Зажмите одну нить шовного материала гемостатом и согните ее, образуя петлю меньшего размера, конец которой должен быть прикреплен максимально близко к скрутке на исходной большой петле.

Обрежьте лишнюю проволоку и отогните скрученную проволоку назад. Остановите любое избыточное кровотечение с помощью стиков с нитратом серебра. Дайте животному восстановиться в течение пяти-семи дней перед разгрузкой задних конечностей или hu после операции.

Для предотвращения спутывания хвостовых колец закрепите их по отдельности. Поместите поверх клетки стальную прорезанную пластину толщиной 3/8 дюйма и шириной один дюйм, затем зафиксируйте её лентой. Добавьте еще одну шайбу и барашковую гайку, но не затягивайте их полностью, чтобы позже была возможность произвести регулировку.

Вставьте винт через центральное отверстие бобины, чтобы предотвратить ее выпадение. На конец винта накрутите нейлоновую контргайку. Бобина должна свободно вращаться.

Вставьте карабин от рыболовного вертлюга в нижнюю часть бобина. С помощью плоскогубцев согните скрепку в форме S-образного крючка. Проденьте один конец S-образного крючка в отверстие рыболовного вертлюга и плотно зажмите его плоскогубцами.

Поместите проволоку в форме буквы U параллельно винту внутри клетки и загните концы через боковую стенку. Чтобы закрепить полную бутылку с водой, вставьте бутылку в U-образную проволоку носиком вниз, чтобы она не касалась дна. Зафиксируйте бутылку на клетке с помощью армированного скотча.

Разогните двухдюймовый зажим-биндер, оставив достаточное натяжение, чтобы удерживать несколько кусочков корма, не раздавив гранулы перед процедурой разгрузки задних конечностей. Запишите вес мыши для последующего сравнения. Позже вставьте открытый конец S-образного крючка в маленькое кольцо, выступающее из хвоста.

Отрегулируйте высоту положения мыши, затягивая или ослабляя нижнюю гайку-барашек на винте устройства. Нижние конечности не должны быть опорными. После достижения оптимальной высоты затяните верхнюю гайку-барашек и переместите бутылку с водой, изменив форму проволоки таким образом, чтобы мышь не могла запрыгнуть на носик бутылки задними конечностями.

Для измерения потребления корма в ходе исследования взвесьте гранулы перед тем, как поместить их в зажим для пакетов. Поместите около 8–10 г корма, чтобы обеспечить потребление примерно 5–6 г корма в день. В каждом месте расположения мыши закрепите зажим с кормом на дне клетки с помощью армированного скотча так, чтобы мышь не могла на него забраться.

Используйте два треугольных лоскута (горов) размером два на два дюйма, располагая их свободно. Намотайте хвост на рыболовный вертлюг. Обмотайте небольшой кусочек хвоста вокруг горов, чтобы закрепить их на хвосте.

Этот этап важен для предотвращения свисания хвоста вниз, что может привести к скоплению крови в кончике и последующему некрозу хвоста. Повторите ту же процедуру для другого животного на противоположной стороне клетки. При содержании двух животных в одной клетке расположите их так, чтобы они почти соприкасались друг с другом.

В центре клетки. Я добавляю в клетку небольшое количество кукурузного наполнителя, следя за тем, чтобы его было недостаточно для того, чтобы мышь могла сформировать из него гнездо. После процедуры разгрузки задних конечностей извлеките животное из аппарата и снимите кольцо с хвоста.

С помощью кусачек для проволоки зафиксируйте массу тела и верните животное в домашнюю клетку для восстановления. После периода восстановления животных снова взвешивают, а затем измеряют массу камбаловидной мышцы и надпочечников. Масса тела до операции по удалению хвоста существенно не отличалась от показателей через пять дней после операции и до hu.

Хотя разгрузка задних конечностей в течение 14 и 28 дней привела к небольшой, но статистически незначимой потере массы тела, мыши полностью восстановили массу тела до уровня, предшествующего HU, после трех дней восстановления. Здесь показано потребление пищи для мышей контрольной группы (амбулаторных) и мышей группы HU.

Среднесуточное потребление корма у мышей в группе HU в течение 28 дней не отличалось от показателей контрольной группы. После воздействия HU в течение 14 и 28 дней наблюдается значительная атрофия камбаловидной мышцы, что свидетельствует об эффективности процедуры после трех дней восстановления. Масса камбаловидной мышцы была значительно выше, чем в обеих группах HU, но все же оставалась значительно ниже, чем у животных из контрольной группы, находившихся в условиях нормального передвижения.

Левая и правая надпочечники были иссечены и взвешены для оценки уровня стресса у животных. Как видно здесь, средний вес надпочечников был сопоставим у мышей контрольной группы и группы HU. После освоения методики операция по подготовке («tailoring surgery») может быть выполнена за 5–10 минут на одну мышь, а подготовка клетки после этой процедуры занимает 15 минут. Для ответа на дополнительные вопросы, например, о том, как мышечная и костная системы восстанавливаются и реагируют на длительные периоды бездействия, могут быть применены другие методы, такие как ограничение подвижности конечностей (limb reloading) и изучение восстановления после атрофии от бездействия.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться четкое представление о том, как проводить разгрузку задних конечностей у мышей. Этот метод позволяет изучать различные ткани и системы, такие как сердечно-сосудистая, опорно-двигательная и др., в условиях разгрузки и повторной нагрузки, используя различные модели мышей, например, нокаутные или нок-ин линии.