Локализация белка в 3D нейронные культуры стволовых клеток: Гибридные Методология Визуализация

При культивировании в суспензии нейральные клетки-предшественники, выделенные из нейрогенных ниш головного мозга, пролиферируют с образованием нейросфер. В данной работе мы демонстрируем методы выделения и серийного срезания свободно плавающих постнатальных нейросфер, производных гиппокампа, для локализации экспрессии белков внутри трехмерной нейросферы. Мы проведем иммуноокрашивание на интересующий нас белок, в данном случае Conexion 29, с последующей сборкой и преобразованием двухмерных микроскопических изображений в трехмерную реконструкцию нейросферы.

Визуализация белков в контексте их нативных трехмерных структур, таких как свободно плавающая нейросфера или ткань, позволяет лучше понять функцию белка на основе его локализации в этих структурах, а также сделать выводы о возможных правилах для белков с известной локализацией, но неизвестными функциями. Здравствуйте, я София Амбо из Лаборатории регенерации нейронов Университета Оттавы. А я Николас Валенсуэла из Студии иммерсивных медиа Карлтон при Университете Карлтона в Оттаве.

Сегодня мы продемонстрируем, как изолировать, экспандировать и проводить серийное секционирование постнатальных нейральных прогениторных клеток гиппокампа в виде нейросфер. Для локализации экспрессии белков с помощью иммуноокрашивания мы будем использовать двумерные изображения серийных срезов нейросфер, полученных после окрашивания, чтобы проиллюстрировать метод реконструкции расположения клеток и белков в трехмерной структуре и тем самым оценить пространственную организацию экспрессии белков во всей нейросфере. Итак, приступим.

После извлечения мозга подготовьте его к установке на предметный столик, создав плоскую поверхность для надежной фиксации образца. Этот процесс называется блокировкой. Выполните блокировку мозжечка с помощью лезвия бритвы и пинцета.

Затем нанесите каплю суперклея на зажим и закрепите на нем первый мозг передней стороной вверх, а дорсальной стороной к себе. Повторите эти действия с остальными образцами мозга; для последнего мозга целесообразно расположить дорсальную сторону от себя, так как в этом направлении разрезание иногда бывает неполным. В случае неполного разрезания используйте скальпель, чтобы дорезать ткань и извлечь срез.

На этапе приклеивания скорость имеет решающее значение, так как мозг не может подвергаться воздействию воздуха в течение слишком длительного времени. После того как все образцы мозга приклеены, зажим помещают в вибратом, а держатель заполняют ледяной жидкостью СМЖ.

Установите на вибраторе частоту 8,5 и скорость от 3,5 до 4,5. Приведите лезвие в контакт с A CSF и установите автоматическую резку. Теперь мы подготовим срезы толщиной 500 мкм.

Оставьте срезы, содержащие гиппокамп. Поместите их в чашку с ледяным A CSF, а остальные срезы удалите. После сбора всех необходимых срезов переходите к диссекции гиппокампа.

Используя стереомикроскоп, мы выделяем только дорсальный гиппокамп в диапазоне примерно от -1,65 мм до -2,10 мм от bregma. Поместите гиппокампы в пустую охлажденную льдом чашку. Когда все гиппокампы будут собраны из срезов, их следует перенести в ламинарный шкаф для механической диссоциации.

Опрыскайте лезвие скальпеля 70% ethanol и простерилизуйте его в пламени. Разрежьте ткань скальпелем до тех пор, пока она не станет жидкой. Теперь, используя среду для диссоциации, уже содержащую pepane DNAs и нейральную протеазу, соберите ткань с помощью пипетирования и перенесите в пробирку объемом 15 мл.

Для ферментативного расщепления поместите пробирку в ротационный инкубатор, установленный на 37 °C, и оставьте для переваривания от 45 минут до одного часа. По завершении расщепления добавьте 10 мл стерильного PBS для культур тканей, чтобы остановить ферментативную реакцию, и центрифугируйте клетки при 300 ×g в течение пяти минут. Удалите супернатант и ресуспендируйте осадок.

В пяти миллилитрах PBS с помощью пастеревской пипетки подвергните образец тритурации для дальнейшей диссоциации ткани. Продолжайте тритурацию до тех пор, пока фрагменты ткани не перестанут уменьшаться в размере. После этого снова осадите клетки центрифугированием.

Удалите PBS и ресуспендируйте осадок в трех миллилитрах поддерживающей среды. После этого тщательно тритурируйте образец. Возьмите аликвоту объемом 15 µL и смешайте ее с равным объемом трипанового синего.

Возьмите две пробы по 10 µL и занесите их в гемоцитометр для подсчета клеток. Подсчитайте клетки в трех полях каждого раздела, всего в шести полях. Вычислите среднее значение для определения плотности клеток.

Учитывая, что образец разведен, распределите клетки в чашках с низкой адгезией в триан-синем растворе с плотностью 2,5 × 10⁵ клеток на чашку в конечном объеме 5 мл поддерживающей среды. Если чашки с низкой адгезией недоступны, можно использовать чашки Петри.

В данном случае в течение первых шести дней необходимо ежедневно, утром и днем, аккуратно постукивать по стенкам чашек, чтобы нейросферы не прилипали к дну. Перед помещением чашек в инкубатор добавьте EG, F и FGF. Эти факторы роста следует обновлять каждые два дня на протяжении всего периода культивирования. На 14-й день in vitro зафиксируйте нейросферы, добавив непосредственно в культуру формальдегид до конечной концентрации около 4%, и инкубируйте при комнатной температуре в течение 20 минут.

Осадите клетки путем центрифугирования при 300 ×g в течение пяти минут. Дважды промойте клетки PBS и ресуспендируйте их в 15–20% растворе сахарозы, приготовленном на 10 мМ фосфатном буфере. Оставьте для криопротекции при 4 °C не менее чем на 24 часа перед нарезкой на криостате.

Извлеките криоконсервированные нейросферы из холодильника и поместите их в чашку диаметром 60 мм. Для серийного срезания, когда крайне важно собрать каждый отдельный срез, я рекомендую отбирать нейросферы подходящего размера и формы с помощью стереомикроскопа; затем с помощью пипетодозатора перенесите нейросферу в криоформу, заполненную соединением OCT. Отметьте на криоформе место расположения нейросфер.

Этот этап поможет найти нейросферы при секционировании. После того как 5–10 сфер были быстро помещены в форму, заморозьте их с помощью CO2. Используя разметку на криоформе, отметьте расположение нейросфер непосредственно на замороженном блоке OTC.

Извлеките блок OCT из формы и поместите его на зажим криостата. Зафиксируйте форму на зажиме с помощью CO2 и поместите её в криостат. Дайте образцам стабилизироваться в течение не менее 30 минут.

После завершения этой операции быстро сделайте срезы по меткам, нанесенным на форму, а затем приступайте к сбору всех последующих секций. С помощью светового микроскопа проверьте, где начинаются срезы нейросфер. По завершении секционирования храните предметные стекла в морозильной камере до начала проведения иммунохимического анализа. Для этого этапа извлеките стекла с одной из серийно разрезанных нейросфер, а также стекла с пятью предшествующими и пятью последующими секциями.

Это позволит вам получить изображения всей нейросферы. Использование ядерного контрастирования обязательно для поиска всех срезов вашей нейросферы. Учитывайте это при планировании иммуноокрашивания. Обработайте стекла PBS и выдержите их при комнатной температуре не менее пяти минут; мы используем буфер для антител, содержащий 0,3% Triton X 100 для пермеабилизации и 3% бычьего сывороточного альбумина для блокировки.

Разведите первичный антитело в данном буфере соответствующим образом и инкубируйте в камере для образцов человека в течение ночи при температуре четырех градусов. Используйте PBS, чтобы приподнять параформ над нейросферами, и осторожно удалите ее с помощью пинцета. Это первая из четырех пятиминутных промывок в PBS.

Нанесите вторичные антитела на предметные стекла и инкубируйте их при комнатной температуре в течение одного часа. Как и ранее, снимите параформ с предметного стекла с помощью PBS и удалите его пинцетом. Это первая из четырех пятиминутных промывок в PBS.

При третьей промывке мы используем HOS 3 3 2, 5 8 в качестве ядерного контрастного красителя, разведенного до концентрации 0,5 micrograms per milliliter. После промывки с использованием HOS следует еще одна пятиминутная промывка в PBS. По завершении всех этапов промывки нанесите достаточное количество среды для заключения на нижнюю часть предметного стекла и накройте его стеклом-покрывателем.

Закрепите углы с помощью лака для ногтей. После того как все предметные стекла будут закрыты покровными стеклами, зафиксируйте остальные края покровных стекол. Снимите изображение со стекла сразу или храните их при температуре -20 °C до начала съемки.

При микроскопии самым сложным этапом является поиск клеток на предметном стекле; обнаружить клетки, принадлежащие нейросфере, будет проще, если искать их по ядерному контрастному окрашиванию. Как только вы найдете начало нейросферы, которая может состоять всего из нескольких клеток, делайте снимки каждого последующего среза. Снимайте ядерное окрашивание, интересующий вас белок или белки, а также изображение в фазовом контрасте.

Это фазово-контрастное изображение будет иметь большое значение на этапах моделирования. Изображения с встроенными масштабными отрезками 10 micrometers и 50 micrometers, установленными в программном обеспечении open lab 3.56, импортируются в Photoshop CS 4 с использованием стандартного размера холста 3 300 на 2 550 пикселей.

Все изображения серийных срезов сохраняются в формате TIFF с соблюдением стандартного размера холста. Откройте контрастные изображения первой и второй фаз серийных срезов нейросфер. Увеличьте прозрачность второго среза на вкладке «Изображение», откройте функцию поворота изображения и выберите произвольный угол.

Поворачивайте второй срез до тех пор, пока не сможете определить точки геометрической и структурной непрерывности между изображениями. Повторите процедуру для всех серийных срезов, сохраняя каждый срез как отдельный слой. Убедитесь, что слои изображений, соответствующие фазовому контрасту и экспрессии белков, связаны между собой, чтобы все повороты для каждого канала выполнялись одновременно.

Создайте в Maya плоскость, пропорции которой соответствуют файлу Photoshop, используя строку состояния пользовательского интерфейса Maya. Переключите панель меню из стандартного режима анимации (animation) в режим поверхностей (surfaces). Выделите примитив «сфера с подразделением» (subdivision sphere), чтобы создать тело клетки.

Начните манипулировать вершинами, щелкнув правой кнопкой мыши по объекту и выбрав пункт vertex в контекстном меню. Далее детализируйте поверхность сферы, изменив уровень отображения в контекстном меню на вкладке subdivision surfaces главного меню. Откройте окно параметров collapse hierarchy и установите количество уровней на два.

Сверните сферу. При выбранной сфере переключите панель меню с поверхностей (surfaces) на полигоны (polygons). Откройте инструмент скульптурирования геометрии (sculpt geometry) на вкладке сетки (mesh) главного меню.

Доведите поверхность клетки до окончательной формы. Для этого используйте набор инструментов скульптурирования геометрии (sculpt geometry) на вкладке настроек инструментов. Повторите этот процесс для каждой клетки вашего типажа, чтобы имитировать разнообразие клеток-предшественников, присутствующих в нейросферах.

В данной демонстрации 10 различных клеток-предшественников послужат основой для нейросферы. Выберите типологию клеток и примените операции заморозки трансформаций к клеткам выбранной вами типологии. Будут разработаны два поверхностных шейдера для отображения как клеток, экспрессирующих белок connects в 29, так и клеток, в которых данный белок отсутствует.

Откройте окно HyperShade на вкладке редактора рендеринга окон в главном меню. Выберите ramp shader (градиентный шейдер) на вкладке материалов поверхности. Откройте редактор атрибутов и настройте атрибуты цвета шейдера, собственного свечения (incandescent), окружающего освещения (ambient), рельефа (bump), карту (map) и цвет блика (specular color).

Назначьте текстуру Броуновского движения 3D узлу цвета окружающей среды (ambient color), а 2D фрактальную текстуру — узлу карты рельефа (bump mapping). Выделите результирующие входные и выходные соединения шейдера и экспортируйте выбранную сеть. Выберите типологию клеток и откройте окно параметров экспорта выделенного объекта.

Выберите тип файла Maya A-S-C-I-I и снимите флажок include these inputs в разделе export selection. Откройте файл с выровненными серийными срезами в Adobe Photoshop. Создайте систему обозначений карандашными штрихами, чтобы отметить положение каждой клетки-предшественника на серийных срезах.

В данной демонстрации используется условное обозначение, состоящее из трех символов: закрашенный квадрат, квадрат с пунктирной линией и квадрат с крестом указывают на то, находится ли клетка в одной, двух или трех секциях.

Данная цветовая схема дополнительно определена следующим образом: красный цвет обозначает клетки, экспрессирующие conexion 29, а белый — клетки, не экспрессирующие Conexion 29. Включите фазовый слой и начните отмечать центр каждой клетки-предшественника белым карандашом. Для построения карт используйте отдельный слой в папке раздела.

Переключайтесь между срезами, чтобы определить положение клеток, убедившись, что клетки, расположенные на нескольких срезах, отмечены надлежащим образом. При включенном слое CX 29 выберите клетки, которые попадают в области с положительной экспрессией CX 29.

Выберите команду «Заливка» (Fill) на вкладке «Редактирование» (Edit) в главном меню Photoshop и замените белые линии на красные после завершения отрисовки карт. Сохраните каждый раздел как отдельное изображение в формате JPEG в папке с исходными изображениями (source images) проекта Maya. Для этого сначала необходимо создать новый проект Maya через строку состояния в пользовательском интерфейсе Maya.

В меню измените настройку анимации по умолчанию на импорт полигонов (polygons import the planes). Выполните ma и настройте масштабную линейку. Используйте ma-файлы из папки projects seen с выбранной плоскостью (plain selected).

Назначьте шейдер Lambert, щелкнув правой кнопкой мыши по объекту и открыв вкладку назначения нового материала (assign new material) в редакторе атрибутов. В появившемся меню нажмите на клетчатый квадрат справа от атрибута цвета материала. В редакторе атрибутов в разделе атрибутов файла выберите пункт «файл» (file) в секции 2D-текстур.

Нажмите на иконку файла справа от атрибута имени изображения. Выберите первый раздел из папки исходных изображений. Переключите камеру окна рабочей области из перспективного вида в стандартный ортографический вид сверху, открыв соответствующую вкладку панели.

Выберите инструмент создания многоугольника (create polygon tool) на вкладке сетки (mesh) главного меню и обведите контур сечения. Выберите первое изображение из папки исходных изображений (source images) и назначьте его созданной плоскости многоугольника. Выделив объект, выполните шаги по созданию плоскости многоугольника, затем нажмите правую кнопку мыши над плоскостью и выберите пункт UV в появившемся меню разметки.

Выберите все UV-точки плоскостей и откройте редактор UV-текстур через вкладку Windows главного меню, пропорционально масштабируйте UV так, чтобы они соответствовали сечению плоскости. Повторите этот процесс для каждого сечения нейросферы, следя за тем, чтобы расстояние между сечениями соответствовало высоте шкалы масштаба в строке состояния пользовательского интерфейса Maya. Переключите панель меню из стандартного режима анимации (animation) в режим динамики (dynamics), оставив видимой только первую секцию нейросферы.

Скройте все остальные разделы, изменив настройки отображения на вкладке display в главном меню; когда окно с параметрами инструментов кривых CV открыто, выберите one linear в настройках кривой CV. Рассматривая сцену с камеры верхнего вида, начните назначать точки на карты клеток, создавая одну кривую для отрицательных клеток CX 29 и одну для положительных клеток CX 29. Полученные кривые выглядят плоскими при просмотре с камеры бокового вида.

Определите приблизительную толщину срезов, перемещая точки кривой по оси Y, используя масштабную линейку в качестве ориентира. Повторите этот процесс для каждого среза нейросферы.

Импортируйте файл cell typology.ma из папки scenes проекта и продублируйте типологию клеток для предшественников как CX 29 отрицательных, так и CX 29 положительных. Откройте окно Hypershade во вкладке Windows Rendering Editors главного меню.

Импортируйте ранее созданные шейдеры, назначая их ячейкам типологии из окна аутлайнера. Удалите имя файла из начала названий импортированных объектов. Это станет важным на последующих этапах процесса моделирования.

Выберите вкладку particles в главном меню и создайте излучатель частиц для первой кривой циклической вольтамперометрии (CV). Откройте вкладку particle shape и в разделе emission attributes измените значение max count с -1 на количество точек на вашей первой кривой. На вкладке render attributes измените тип рендеринга частиц (particle render type) на blobby surface.

Нажмите на поле текущего типа визуализации ниже и измените радиус частиц на 0.01. Чтобы привязать частицы к вершинам кривой, сначала выберите частицы, затем, удерживая клавишу Shift, выберите кривую.

Откройте параметры цели (goal options) во вкладке частиц (particles) главного меню и установите вес цели (goal weight), равный одному. Нажмите Create. Выберите в окне Outliner ячейки с первого по десятую по порядку, затем откройте окно параметров мгновенной замены (instant replacement options) во вкладке частиц (particles) главного меню.

В окне объектов экземпляров должны быть перечислены все 10 ячеек по порядку. Выберите подходящее название формы частиц из выпадающего списка на вкладке создания экземпляра объекта частиц. Нажмите «Создать» (Create). По умолчанию только первая выбранная ячейка заменит частицы вдоль кривой; чтобы отобразились все 10 ячеек и они случайным образом чередовались между частицами, необходимо использовать выражение.

Второе выражение обеспечит случайное излучение клеток одинаковым образом при каждом запуске. Ползунок диапазона перемещается при выбранном излучателе. Откройте редактор атрибутов во вкладке формы частиц в разделе добавления динамического атрибута.

Нажмите на общее поле под длинным именем. Введите случайный индекс с подчеркиванием в поле атрибута, переключите тип с «scaler» на «per particle array» и нажмите «add» во вкладке атрибутов «per particle array». Поле со случайным индексом с подчеркиванием было добавлено.

Щелкните правой кнопкой мыши по пустому пространству и выберите «создать выражение» (create expression) в выпадающем списке. Введите следующий текст в поле выражения, чтобы завершить его создание. Откройте вкладку «мгновенный поиск замены геометрии» (instant search geometry replacement) в редакторе атрибутов и в общих опциях выберите индекс объекта (object index).

Выберите случайный индекс нижнего подчеркивания из выпадающего списка. Переместите ползунок времени на первый кадр и нажмите кнопку воспроизведения. Теперь типы клеток распределены по частицам случайным образом.

Повторите этот процесс для каждой секции нейросферы. Убедитесь, что каждый новый экземпляр эмиттера и случайный индекс имеют разные имена и соответствующим образом организованы в окне аутлайнера при рендеринге. В разделе окна настроек рендеринга измените режим рендеринга с Maya software на mental ray.

Откройте вкладку Quality (Качество) и в разделе Ray Tracing (Трассировка лучей) установите значение Reflection (Отражения) на ноль. Откройте вкладку Frame Buffer (Буфер кадра), измените параметр Color Clip (Обрезка цвета) с Raw (Необработанный) на Alpha (Альфа-канал) и снимите флажок с Pre multiply (Предварительное умножение).

Откройте редактор слоев в окне Channel Box и измените настройки редактора слоев с display на render. Выберите импортированные ячейки типологии, нажмите иконку создания нового слоя и назначения выбранных объектов. Переименуйте слой в ambient occlusion.

Щелкните правой кнопкой мыши по только что созданному слою и выберите «Attributes» (Атрибуты) в меню справа от поля рендер-слоя. Нажмите кнопку «Presets» (Пресеты) и выберите «Occlusion» (Окклюзия) из выпадающего списка. Перейдите на вкладку «MIB_AMB_occlusion1» и измените количество выборок (samples) с 16 на 256.

Снова откройте редактор слоев окна каналов и на вкладке параметров откройте окно опций рендеринга всех слоев, выберите composite и оставьте выбранным слой ambient occlusion. В выпадающем списке прямо над списком слоев измените режим с normal на multiply. Выполните два прохода рендеринга сферы neuros: один раз с включенным слоем ambient occlusion и один раз с включенным основным слоем (master layer). Сохраните изображения в формате IFF в папке с изображениями проекта.

Откройте оба изображения в Adobe Photoshop. Расположите слой с затенением (ambient occlusion) над основным слоем и установите для него режим наложения «Умножение» (multiply). Создайте фоновый слой и объедините все слои изображения.

Мы только что продемонстрировали вам способ культивирования нейрогенных клеток, производных из гиппокампа, в виде нейросфер, а также способ серийного секционирования культуры нейросфер с помощью криостата и метод проведения иммуноокрашивания для выявления интересующего белка. Мы также показали, как моделировать пространственную локализацию экспрессии этого белка в трех измерениях, используя сочетание регистрации клеточных культур и программного обеспечения для трехмерного моделирования.

Мы надеемся, что это будет вам полезно, и желаем удачи в ваших экспериментах.