Органотипической Анализ фрагментов для высокого разрешения Time-Lapse Визуализация миграции нейронов в послеродовой мозга
11 декабря 2010 г.
Этот протокол описывает органотипической анализа ломтик оптимизирован для послеродового мозга и высоким разрешением, замедленная съемка нейробластов миграции в ростральной миграционных потоков.
Я — Трой Гасай. Мы обсудим метод анализа органотипических срезов, который был усовершенствован в моей лаборатории за последние несколько лет. Бен Джакет из моей лаборатории продемонстрирует вам, как проводится этот анализ.
Метод анализа органотипических срезов постнатального мозга является мощным инструментом для тестирования различных факторов и изучения их роли в миграции нейронов в постнатальном мозге и в миграционном потоке TRO. Здравствуйте, я Бен Джейкей, постдокторант в лаборатории доктора Троя Гги в Колледже ветеринарной медицины Университета штата Северная Каролина. Сегодня я покажу вам, как мы выполняем перекрестную трансплантацию тканей между органотипическими срезами мозга мыши для визуализации мигрирующих нейробластов в постнатальном мозге.
Все методы, описанные в данном видео, следует выполнять в стерильных условиях, предпочтительно в ламинарном шкафу, используя стерилизованные инструменты. Каплю среды для срезов объемом 150 µL наносят в центр стеклянного дна чашки с помощью одноразового шприца, оснащенного иглой 23G. По периметру круглой стеклянной покровной пластинки наносят несколько точек клея, оставляя одну сторону незаклеенной для обмена жидкости A. Затем мембрану ядерных пор осторожно помещают поверх среды с помощью микропинцета, следя за тем, чтобы под мембраной не оставалось пузырьков воздуха.
Затем с помощью изогнутого пинцета расплющивают капли клея и закрепляют мембрану на месте. Сверху на мембрану добавляют 1 mL среды для срезов, после чего чашки помещают в инкубатор до начала использования. Лучшие результаты достигаются при подготовке срезов от молодых постнатальных мышей с P1 по P10; сначала голову стабилизируют, удерживая морду микропинцетом.
Кожу иссекают продольно от шеи к носу. Кожу головы отделяют, чтобы обнажить кость, и череп разрезают продольно и спереди, начиная от sternum magna, выполняя один медиальный и два латеральных разреза, по одному с каждой стороны. Следует соблюдать осторожность, чтобы свести к минимуму контакт с нижележащей корковой тканью.
Черепные лоскуты удаляются от мозга для повышения стабильности ткани. В процессе вибротомического секционирования латеральные и каудальные отделы мозга удаляются с помощью лезвия бритвы. Два полушария осторожно извлекают из черепа и помещают в форму для заливки медиальной поверхностью вниз.
Их немедленно заливают расплавленным 3% агарозным гелем (сорта DNA grade), растворенным в буфере для подготовки тканей, который поддерживают при температуре 37 °C. После двух минут стабилизации на плоской горизонтальной поверхности формы помещают на лед для полного затвердевания агарозы, чтобы обеспечить равномерное застывание.
После застывания геля, содержащего полушария, его извлекают из формы и обрезают по контуру ткани мозга. Затем ткань, заключенную в гель, закрепляют на диске для образцов вибротома медиальной поверхностью вверх с помощью цианоакрилатного клея. Диск устанавливают в лоток вибротома, заполненный ледяным раствором для подготовки тканей, и производят секционирование мозга с толщиной срезов 150 micrometer.
После того как срезы, содержащие RMS, отделяются от лезвия, их осторожно извлекают с помощью маленького плоского шпателя и аккуратно помещают в центр чашек для культивирования. Крайне важно свести манипуляции со срезами к минимуму, так как ткань очень хрупкая. Количество среды в чашках регулируют до уровня, достаточного для полного покрытия срезов мозга, чтобы предотвратить их перемещение.
Чашки маркируют и переносят в инкубатор. Мозг донора подготавливают аналогично мозгу реципиента, за исключением того, что срезы делают толщиной 250 µm и собирают их на льду.
Подготовка тканей в охлажденном состоянии. Срезы в буфере немедленно помещают под диссекционный микроскоп с возможностью эпифлуоресценции. RMS видна как серая U-образная структура, простирающаяся от субэпендимальной зоны до обонятельной луковицы.
RMS осторожно подвергают микродиссекции с помощью микропинцетов. Один пинцет используется для стабилизации среза, а другой — для выполнения небольших надрезов вокруг RMS до тех пор, пока структура не будет отделена от среза. Затем иссеченную область RMS разрезают на небольшие эксплантаты диаметром примерно от 200 до 500 micrometers.
В данном примере используются эксплантаты, полученные от мышей, экспрессирующих красный флуоресцентный белок TD tomato glass. Чашки Петри с фрагментами тканей реципиента извлекают из инкубатора и помещают под диссекционный микроскоп с использованием видимого света. В начальном сегменте RMS реципиента делают небольшой надрез, после чего с помощью пипеточного дозатора с наконечником на 20 µL один донорский эксплантат RMS переносят в место надреза в RMS реципиента.
Эксплантат осторожно вводят в разрез для установления контакта между двумя тканями. Чтобы обеспечить стабильность этого контакта, эксплантат слегка прижимают между срезом и пористой ядерной мембраной. Затем чашки возвращают в инкубатор минимум на один час, чтобы срезы закрепились на мембране.
Нейробласты должны начать миграцию из экспланта в RMS хозяина примерно через один-два часа. Миграция клеток лучше всего визуализируется с использованием 20-кратных объективов с увеличенным рабочим расстоянием. Культивируемые ткани переносят из инкубатора в термостат микроскопа.
Визуализацию флуоресцентных нейробластов можно проводить с интервалами от 0 до 10 минут в зависимости от целей анализа. Наш протокол культивирования типических срезов органов был тщательно протестирован и оптимизирован за последние несколько лет для обеспечения стабильности паттернов миграции и ориентации в RMS. В данном примере анализ клеток, мигрирующих из экспланта, полученного от мышей, у которых TD tomato экспрессируется под промотором nestin, демонстрирует высокоориентированную и быструю миграцию в RMS реципиента.
Большое увеличение. Анализ в режиме таймлапс демонстрирует отличное разрешение по всей длине мигрирующего нейробласта во время 20-минутного сеанса визуализации. После завершения визуализации срезы фиксируют ледяным холодным свежеприготовленным 4% раствором параформальдегида и подвергают иммуноокрашиванию на различные компоненты миграционного потока.
В данном случае с помощью флуоресцентной иммуногистохимии выявлены GFAP-положительные астроциты (синий цвет) и CD 31-положительные кровеносные сосуды (зеленый цвет); анализ срезов, окрашенных на цитоскелетные белки актин (синий цвет) и тубулин (зеленый цвет) при большом увеличении, демонстрирует неравномерную экспрессию этих компонентов в клетке, находящейся в процессе миграции. Наш протокол сопряжен с определенными трудностями, которые требуют терпения, практики и значительных временных затрат как на подготовку, так и на анализ полученных результатов.
Ниже приведены полезные рекомендации, которые помогут вам добиться наилучших результатов в экспериментах. По нашему опыту, наилучшие результаты дают мыши в возрастном диапазоне от P1 до P10. Подбор по возрасту между мозгом донора и реципиента также повышает воспроизводимость экспериментов.
Поскольку большинство реагентов и культуральных чашек должны быть подготовлены непосредственно перед использованием, наш анализ срезов требует нескольких часов непрерывной подготовки и визуализации в течение одного дня. После извлечения мозга последующие этапы должны быть выполнены максимально быстро. В промежутке между обезглавливанием и подготовкой срезов все операции следует проводить на льду с использованием охлажденных реагентов; также необходимо свести к минимуму манипуляции с тканью, чтобы избежать анатомических повреждений.
Инструменты, используемые для этих диссекций, должны быть стерильными и предназначены только для манипуляций с живыми тканями. Категорически запрещено использовать инструменты, которые когда-либо контактировали с фиксаторами, такими как формальдегид. Срезы обычно остаются жизнеспособными до 36 часов, при этом заметное снижение миграции, скорости и ориентации наблюдается в интервале от 24 до 36 часов.
Учитывайте данное ограничение при планировании ваших экспериментов и анализе.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе описывается метод анализа органотипических срезов, оптимизированный для постнатального мозга, а также время-лапс съемка с высоким разрешением для наблюдения за миграцией нейробластов в ростральном миграционном потоке. Этот метод позволяет визуализировать мигрирующие нейробласты в постнатальном мозге посредством пересадки перекрестных тканей между органотипическими срезами мозга мыши.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Нейробиология
- Миграция клеток
Теоретическая база
- Анализы органотипических срезов являются мощным инструментом для изучения миграции нейронов.
- Ростральный миграционный поток имеет решающее значение для понимания нейрогенеза в постнатальном мозге.
- Методы визуализации с высоким разрешением улучшают наблюдение за поведением нейробластов.
- Данное исследование сосредоточено на постнатальном мозге, который изучен меньше по сравнению с эмбриональными стадиями.
Цель исследования
- Оптимизировать метод анализа органотопных срезов посмертного мозга.
- Изучить факторы, влияющие на миграцию нейронов в ростральном миграционном потоке.
- Визуализировать миграцию нейробластов с помощью современных методов визуализации.
Используемые методы
- Приготовление органотипических срезов из постнатального мозга мыши.
- Перекрестная трансплантация тканей между срезами мозга.
- Таймлапс-визуализация с высоким разрешением.
- Анализ паттернов миграции нейробластов.
Основные результаты
- Успешная визуализация миграции нейробластов в постнатальном мозге.
- Демонстрация эффективности метода анализа органотипических срезов.
- Представление о динамике нейрональной миграции.
- Потенциальное значение для понимания процессов нейроонтогенеза.
Выводы
- Органотипический анализ срезов является ценным методом изучения миграции нейробластов.
- Данный подход может способствовать более глубокому пониманию развития мозга в постнатальный период.
- Будущие исследования могут опираться на эти результаты для поиска терапевтических путей.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Этот метод анализа органотипических срезов позволяет проводить тайм-лапс визуализацию миграции нейронов в постнатальном мозге с высоким разрешением, предоставляя физиологически релевантную систему для оценки клеточно-автономной и неавтономной регуляции движения нейробластов. Поддерживая подходы перекрестной трансплантации образцов с различным генетическим фоном, данный анализ облегчает валидацию мишеней и снижение механистических рисков на ранних этапах поиска. Он обеспечивает прогностическую достоверность при приоритизации терапевтических кандидатов, влияющих на пути миграции нейронов при нарушениях нейропсихического развития.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверить терапевтические гипотезы путем визуализации направленной и быстрой миграции нейробластов в ростредіальном миграционном потоке в условиях, близких к физиологическим внеклеточным условиям.
- Операционная ценность: обеспечивает функциональную валидацию мишеней посредством количественной оценки скорости, ориентации и паттерна миграции в ответ на генетические или фармакологические воздействия.
- Прогностическая ценность: способствует отбору приоритетных направлений разработки за счет получения измеримых и воспроизводимых результатов, коррелирующих с биологической активностью в системе, соответствующей данной патологии.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Подготовка валидированных биологических систем для последующего скрининга путем поддержания однородных внеклеточных условий, имитирующих среду in vivo для мигрирующих нейробластов.
- Практическая ценность: Получение стандартизированных, воспроизводимых препаратов при минимальном вмешательстве, что снижает вариабельность результатов таймлапс-визуализации.
- Масштабируемость: Возможность повторного использования платформы для различных экспериментальных условий, что обеспечивает сопоставимость фенотипов миграции.
Трансляционные и доклинические исследования
- Значимость для изучения заболеваний: Моделирует области постнатального нейрогенеза — субэпендимальную зону, ростральный миграционный поток и обонятельную луковицу — для изучения механизмов, имеющих прямое отношение к патогенезу нарушений нейроразвития.
- Трансляционная преемственность: Связывает этап фундаментальных открытий с доклинической валидацией, предоставляя релевантную для заболеваний систему, в которой можно проводить лонгитюдный мониторинг динамики миграции.
- Прогресс с учетом рисков: Обосновывает решения о целесообразности дальнейшего продолжения исследований (go/no-go), выявляя неравномерную экспрессию цитоскелетных белков в процессе миграции, что позволяет определить потенциальные побочные эффекты на клеточный аппарат.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный анализ вписывается в континуум открытий: от проверки гипотез об мишенях через идентификацию соединений-лидеров до доклинической валидации, особенно в отношении модификаторов миграции нейронов при постнатальном развитии мозга.
- Открывающая биология: способствует проверке гипотез и уточнению путей передачи сигналов, позволяя напрямую наблюдать миграцию нейробластов в ответ на экспериментальные переменные.
- Скрининг: обеспечивает готовность метода анализа за счет стандартизированной подготовки срезов и трансплантации, что позволяет получать количественные данные о траектории и скорости миграции.
- Аналитика: генерирует данные тайм-лапс съемки высокого разрешения и результаты иммуногистохимического анализа, которые позволяют сравнивать условия на основе целостности миграции и динамики цитоскелета.
- Трансляционные исследования: связывает метод с доклинической работой, моделируя систему, релевантную заболеванию, при котором миграция нейронов является ключевым патофизиологическим процессом.
- Корпоративное повторное использование: функционирует как многократно используемая технология в различных проектах, сокращая избыточную разработку моделей и обеспечивая межисследовательское сравнение фенотипов миграции.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает точность прогнозов за счет снижения механистической неопределенности в анализах миграции нейронов благодаря прямой визуализации с высоким разрешением.
- Операционная ценность: Улучшает стандартизацию и воспроизводимость за счет оптимизированных протоколов культивирования срезов и минимизации манипуляций с тканью.
- Стратегическая ценность: Повышает эффективность использования капитала, позволяя на ранних этапах снизить риски при работе с мишенями, влияющими на миграцию, что сокращает количество неудач на поздних стадиях из-за непредвиденных биологических эффектов.
- Влияние на портфель: Поддерживает приоритезацию с учетом рисков, предоставляя количественные конечные точки на основе визуализации, которые служат основанием для принятия решений о продвижении проектов в рамках разработки средств для лечения нарушений нейроразвития.
Особенности реализации
- Требуются навыки препарирования мозга постнатальных животных, выполнения вибратомного среза и стерильной работы с тканями для поддержания жизнеспособности срезов.
- Метод основан на использовании флуоресцентной микроскопии с объективами с увеличенным рабочим расстоянием и системой контроля условий окружающей среды для таймлапс-визуализации.
- Необходима межгрупповая стандартизация подготовки срезов, процедуры трансплантации и времени проведения визуализации для обеспечения воспроизводимости показателей миграции.
- При применении анализа к различным генетическим линиям или моделям заболеваний требуются определенные адаптации, особенно в отношении подбора пар донор-реципиент, соответствующих по возрасту.
- Возможности метода ограничены жизнеспособностью среза до 36 часов, при этом после 24 часов наблюдаются снижение скорости и нарушение ориентации миграции, что требует завершения эксперимента в тот же день.
