Органотипической Анализ фрагментов для высокого разрешения Time-Lapse Визуализация миграции нейронов в послеродовой мозга

Меня зовут Трой Гасаи. Мы поговорим об органотипическом анализе срезов, который был усовершенствован в моей лаборатории за последние несколько лет. Бен Пиджакет в моей лаборатории покажет вам, как проводится этот анализ.

Органотипический анализ срезов постнатального мозга является мощным методом для проверки различных факторов и их роли в миграции нейронов в постнатальном мозге и миграционном потоке TRO. Привет, меня зовут Бен Джакей. Я работаю в лаборатории доктора Троя в Колледже ветеринарной медицины Университета штата Северная Каролина, и сегодня я здесь, чтобы показать вам, как мы выполняем перекрестную трансплантацию тканей между органотипическими срезами мозга мыши, чтобы визуализировать мигрирующий нейробласт в постнатальном мозге.

Все методы, описанные в этом видео, должны выполняться в стерильных условиях, предпочтительно в вытяжке с ламинарным потоком с использованием стерилизованных инструментов. Капля среднего среза объемом 150 микролитров помещается в центр стакана, в нижнюю часть чашки с помощью одноразового шприца, оснащенного иглой 23 калибра. Несколько клеевых пятен размещаются снаружи круглого стекла нижней крышки, оставляя одну сторону неприклеиваемой для обмена жидкости. Затем мембрана ядерных пор A.A аккуратно помещается поверх среды с помощью микрощипцов, следя за тем, чтобы пузырьки воздуха не задерживались под мембраной.

Затем изогнутые щипцы используются для выравнивания мест клея и закрепления мембраны на месте. Один миллилитр среды для ломтиков добавляется поверх мембраны, и, наконец, посуда помещается в инкубатор до готовности к использованию. Наилучшие результаты получаются при приготовлении срезов от молодых постнатальных мышей, сначала от P one до P ten, голову стабилизируют, удерживая рыло микрощипцами.

Кожа иссекается продольно от шеи до рыла. Кожа головы снимается, чтобы обнажить кость, а череп разрезается продольно и спереди, начиная с большой грудины, делая один медиальный и два боковых разреза, по одному с каждой стороны. Следует соблюдать осторожность, чтобы свести к минимуму контакт с подлежащими кортикальными тканями.

По мере того, как черепные лоскуты удаляются в сторону от мозга для улучшения стабильности тканей. Во время рассечения вибрама с помощью бритвенного лезвия удаляются самые боковые и кодальные аспекты мозга. Два полушария аккуратно вычерпываются из черепа и помещаются медиальной поверхностью вниз в форму.

Они немедленно покрываются расплавленным гелем розы AGA класса 3% ДНК, растворенным в буфере для подготовки тканей, который поддерживается при температуре 37 градусов Цельсия. После двух минут стабилизация на ровной горизонтальной поверхности. Чтобы обеспечить равномерное затвердевание роз ага, формы располагают на льду для завершения схватывания.

После того, как гель, содержащий полушария, схватывается, его удаляют из формы и обрезают вокруг мозговой ткани. Затем внедренная в гель ткань устанавливается на диск образца вибрационного тона медиальной поверхностью вверх и закрепляется цианоакрилатным клеем. Затем диск устанавливается в лоток для вибрационных образцов, заполненный средой для подготовки ледяной ткани, и мозг разрезается на толщину 150 микрометров.

После того, как RMS, содержащие ломтики, высвобождаются из лезвия, их осторожно вычерпывают с помощью небольшого плоского шпателя и кладут плоско в центр тарелок для культуры. Очень важно, чтобы работа со срезами была сведена к минимуму, так как ткань очень хрупкая. Количество среды в питательных чашках доводят до уровня, достаточного для покрытия отделов мозга и предотвращения их перемещения.

Блюда маркируются и передаются в инкубатор. Донорские мозги препарируются таким же образом, как и мозги реципиентов, за исключением того, что срезы обрезаются на 250 градусов. Микрометры толщины и срезы собираются в лед.

Подготовка холодных тканей. Буферные срезы немедленно помещаются под препарирующий микроскоп с возможностью эпифлуоресценции. RMS видна в виде серой U-образной структуры, простирающейся от субэпендимальной зоны до обонятельной луковицы.

RMS мягко микродиссектируется с помощью микрощипцов. Один щипец используется для стабилизации среза, в то время как другой используется для выполнения небольших надрезов вокруг RMS до тех пор, пока он не будет освобожден от среза. Затем иссеченное среднеквадратичное значение разрезается на небольшие x-образные размеры диаметром от 200 до 500 микрометров.

В данном примере баклажаны получают из мышей, экспрессирующих красный флуоресцентный белок, TD томатного стекла. Нижние чашки, содержащие срезы хозяина, извлекаются из инкубатора и помещаются под микроскоп для препарирования с использованием видимого света. Делается небольшой разрез в начальном сегменте RMS и с помощью пипетки, оснащенной наконечником объемом 20 микролитров, один донорский RMS Explan переносится на место разреза в RMS хозяина.

Эксплан аккуратно вводится в разрез, чтобы установить контакт между двумя тканями. Чтобы обеспечить стабильность этого контакта, эксплан слегка проталкивается между срезом и бедной ядрой мембраной. Затем чашки возвращают в инкубатор не менее чем на один час, чтобы секции могли осесть на мембране.

Нейробласт должен начать мигрировать из эксплана в СКО хозяина примерно через один-два часа. Миграцию клеток лучше всего визуализировать с помощью сверхдлинного рабочего расстояния 20 целей мощности. Культивируемые ткани переносят из инкубатора в инкубированную камеру на микроскопе.

Флуоресцентный нейробласт может быть визуализирован с интервалом от нуля до 10 минут в зависимости от типа желаемого анализа. Наш протокол культивирования органических типичных срезов был тщательно протестирован и оптимизирован в течение последних нескольких лет для обеспечения согласованности в схеме миграции и ориентации в среднеквадратичном цикле. В данном примере анализ клеток, иммигрирующих из эксплана, полученного от мышей, у которых TD томат экспрессируется под гнездом в промоторе, показывает высокоориентированную и быструю миграцию в СРС хозяина.

Большое увеличение. Покадровый анализ показывает превосходное разрешение по всей длине мигрирующего нейробласта в течение 20-минутного сеанса визуализации. После того, как визуализация завершена, срезы кожи фиксируются льдом, холодным и свежеприготовленным, 4% параформом, альдегидом и иммуноокрашиванием для различных компонентов миграционного потока.

В этом случае с помощью флуоресцентной иммуногистохимии выявляются GFAP-положительные астроциты синего цвета и CD-31-положительные кровеносные сосуды зеленого цвета, анализ с высоким увеличением срезов, окрашенных на цитоскелетные белки актин в синий цвет, и тубулин зеленого цвета выявляют неравномерную экспрессию этих компонентов клеткой. В разгар миграции. Наш протокол представляет собой некоторые проблемы, которые требуют терпения, практики и времени как для подготовки, так и для анализа ваших результатов.

Итак, вот несколько полезных советов, которые помогут вам получить наилучшие результаты от ваших экспериментов. По нашему опыту, наилучшие результаты дают мыши в возрастном диапазоне от P 1 до P 10. Соответствие возрасту мозга донора и реципиента также улучшает воспроизводимость экспериментов.

Поскольку большинство реагентов и культуральных блюд должны быть свежеприготовленными, наш анализ срезов требует нескольких часов непрерывной подготовки и визуализации в течение одного дня. После того, как мозги собраны, шаги по ликвидации последствий должны быть выполнены как можно быстрее. Между обезглавливанием и подготовкой срезов все этапы должны выполняться с использованием льда, холодных реагентов и манипуляций с тканями следует свести к минимуму во избежание анатомических нарушений.

Инструменты, используемые для этих вскрытий, должны быть стерильными и предназначены только для манипуляций с живыми тканями. Никогда не используйте инструменты, которые когда-либо контактировали с фиксаторами, такими как формальдегид. Срезы обычно жизнеспособны до 36 часов с видимым снижением миграции, скорости и ориентации между 24 и 36 часами.

Остерегайтесь этого ограничения при планировании экспериментов и анализов.