Heterokaryon Техника для анализа типа клеток конкретных Локализация

Общая цель данной процедуры — отслеживание перемещения белка путем экспрессии одного и того же белка, меченного двумя разными флуорофорами, в двух отдельных клеточных линиях с последующим слиянием этих линий. Это достигается путем первоначальной трансфекции плазмид, содержащих интересующий ген, слитый с одним из двух разных генов флуоресцентных белков, в два разных типа клеток. Вторым этапом процедуры является смешивание клеток и обеспечение накопления белка в каждом типе клеток.

Третьим этапом процедуры является ингибирование синтеза белка с последующим слиянием клеток с помощью полиэтиленгликоля. Заключительным этапом процедуры является визуализация локализации белка методом флуоресцентной микроскопии. В конечном итоге с помощью флуоресцентной микроскопии можно получить результаты, демонстрирующие изменение локализации белка или особенностей его транспорта.

Данный метод может помочь в поиске ответов на ключевые вопросы в области биологии рака, например, о том, как меняются отдельные функции и поведение белков по мере трансформации клеток. Хотя этот метод позволяет получить представление об изменениях, специфичных для трансформированных клеток, он также может быть применен в других исследованиях, таких как дифференцировка клеток, биология развития и клеточная сигнализация.

Как правило, исследователи, впервые использующие данный метод, могут столкнуться с трудностями, так как для каждого типа клеток потребуется отдельная оптимизация условий трансфекции и условий слияния. Первым методом введения плазмидной ДНК в клетки, продемонстрированным в данном протоколе, является метод ядерной трансфекции NU, при котором используется раствор Lonza Nuclear Effector. Сначала клетки, которые были недавно пересеяны и находятся в логарифмической фазе роста, промывают фосфатно-солевым буферным раствором PBS и собирают путем трипсинизации. После того как клетки утратят адгезию, действие трипсина нейтрализуют путем добавления среды, содержащей сыворотку, и осаждают клетки центрифугированием при 1500 G в течение пяти минут.

Поместите стерилизованные покровные стекла в шестилуночный планшет в ламинарном шкафу для культур тканей, затем дозируйте пипеткой по 1,5 milliliters полной питательной среды в каждую лунку. Закройте планшет и перенесите его в инкубатор для культур клеток для уравновешивания.

После центрифугирования перенесите пробирки в вытяжной шкаф, аспирируйте супернатант и ресуспендируйте осадок клеток в минимальном объеме PBS. Затем подсчитайте количество клеток и разлейте суспензию клеток по стерильным микроцентрифужным пробиркам. Это обеспечит примерно 5×10⁵ клеток на образец; снова центрифугируйте при 1500 G в течение пяти минут.

По завершении центрифугирования поместите пробирки в ламинарный шкаф для культур клеток, аспирируйте SNA и аккуратно ресуспендируйте клетки в каждой пробирке в 100 microliters раствора ядерного эффектора комнатной температуры. Затем добавьте пять micrograms плазмидной ДНК в каждый образец и перенесите образец в пробирку для ядерного эффектора и закройте ее.

Следите за тем, чтобы не допустить появления пузырьков воздуха. Вставьте кювету с образцом в держатель кювет. Выберите соответствующую программу ядерного эффектора и запустите её.

Для выбора наиболее подходящей программы может потребоваться предварительное тестирование с целью установления оптимальной эффективности трансфекции при минимальной смертности клеток. Затем высейте клетки в 6-луночный планшет либо в виде смешанных популяций, либо раздельно в качестве контролей. Поместите планшет обратно в инкубатор и оставьте клетки для восстановления на 12 часов.

Вторым продемонстрированным методом транзиентной экспрессии плазмид является трансфекция с использованием реагента kagen. Для начала добавьте 0.8 µg каждого образца плазмидной ДНК в 200 µL буфера EC в стерильную центрифужную пробирку. Затем добавьте в каждый образец 6.4 µL реагента-энхансера.

Кратковременно перемешайте содержимое, слегка постучав по пробирке, и инкубируйте в течение двух минут при комнатной температуре. После этой короткой инкубации добавьте по 20 µL действующего реагента в каждый образец. Перемешайте содержимое каждой пробирки, постучав по ней, и инкубируйте в течение 15 минут при комнатной температуре.

Во время инкубации подготовьте две клеточные линии, которые будут использоваться в эксперименте. Для трансфекции клетки должны быть недавно перенесены и находиться в фазе логарифмического роста при слиянии примерно 80%. Один раз промойте клетки раствором PBS, затем добавьте 1,5 milliliters свежей среды DMEM с 10% FBS.

После 15-минутной инкубации реагентов для трансфекции ДНК добавьте в каждый образец 1,2 миллилитра среды DMEM с 10% FBS, перемешайте путем пипетирования и немедленно перенесите по каплям примерно 700 микролитров комплексов в каждую из двух лунок шестилуночного планшета. Перемешайте содержимое путем кругового встряхивания планшета. Оставьте клетки для трансфекции минимум на три часа в инкубаторе в ламинарном шкафу; при необходимости поместите по одному стерилизованному покровному стеклу в каждую лунку шестилуночного планшета.

Для улучшения адгезии клеток можно использовать покровные стекла с покрытием. Затем дважды промойте трансфицированные клетки в PBS и соберите их, используя минимальную трипсинизацию. Для этого добавьте по 100 µL раствора трипсина в каждую лунку, встряхивая планшет для обеспечения полного покрытия.

Затем немедленно аспирируют остатки трипсина. Оставшийся трипсин нейтрализуют, ресуспендировав клетки в 1,5 milliliters свежей среды DMEM с 10%FBS; клетки высевают либо в виде смешанных популяций, либо раздельно в качестве контроля. В шестилуночном планшете с покровными стеклами оставляют клетки для восстановления на 12 часов в инкубаторе для культур клеток.

Независимо от метода трансфекции, процедура создания гетерологичных инфузий остается неизменной. После трансфекции удалите питательную среду из лунок и дважды промойте клетки PBS. Затем рекомендуется обработать клетки циклогексимидом для ингибирования дальнейшего синтеза белков.

Добавьте циклогексимид в концентрации 100 µg/mL в культуральную среду, чтобы покрыть клетки, и инкубируйте в течение двух часов в инкубаторе для культур клеток. Через два часа извлеките клетки из инкубатора и дважды промойте их раствором PBS. Для инициации слияния покройте клетки раствором 50% полиэтиленгликоля 1000 в бессывороточной среде DMEM и инкубируйте в течение 125 секунд.

При комнатной температуре удалите раствор PEG и промойте клетки PBS для удаления остатков PEG. Затем добавьте два миллилитра DMEM с 10% FBS, подогретого до 37 °C. Инкубируйте клетки от 18 до 24 часов в инкубаторе для культивирования клеток.

После инкубации в течение 18–24 часов извлеките планшет из инкубатора и дважды промойте клетки в PBS. Затем внесите в каждую лунку один миллилитр 4% параформальдегида в PBS и осторожно перемешивайте в течение 15 минут.

Во время инкубации подготовьте предметные стекла, добавив на каждое одну каплю среды для заключения, содержащей dpi. Затем дважды промойте фиксированные клетки раствором PBS и осторожно снимите каждое покровное стекло с помощью небольшого пинцета. Удалите остатки PBS с помощью кусочка салфетки, после чего перенесите образец на предметное стекло со средой для заключения и tappi стороной с клетками вниз.

Удалите излишки среды для заключения со стекла с помощью бумажных салфеток и загерметизируйте края покровных стекол. С помощью лака для ногтей. Теперь клетки можно визуализировать с помощью конфокальной или эпифлуоресцентной микроскопии. На данной блок-схеме метод гетеро-анализа для определения специфической локализации белков в зависимости от типа клеток показан в три основных этапа.

Трансфекция плазмидой, экспрессирующей белок с флуоресцентной меткой, при слиянии клеток с использованием полиэтиленгликоля 1000 и визуализация с помощью флуоресцентной микроскопии, как показано на данных эпифлуоресцентных изображениях: первичные фибробласты крайней плоти в качестве самослиянного контроля, экспрессирующие белок VP3 вируса анемии кур с меткой GFP, демонстрируют преимущественно цитоплазматическую локализацию белка в линии немелкоклеточного рака легкого H 1299. Самослиянные контроли с тем же белком VP3 с меткой DsRed демонстрируют преимущественно ядерную локализацию. Гетерокариоз первичных фибробластов крайней плоти и клеток H 1299 приводит к переносу материала трансформированных клеток в первичные фибробласты крайней плоти и вызывает перераспределение меченого GFP белка VP3, производного от первичных клеток, в ядро.

При выполнении данной процедуры важно помнить, что успех будет сильно зависеть от эффективности трансфекции в конкретных используемых типах клеток, а также от оптимизации условий слияния для этих клеток. После выполнения данной процедуры можно применить другие методы, такие как flip и frap, чтобы получить ответы на дополнительные вопросы, касающиеся анализа динамики локализации в режиме реального времени. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как оценивать специфическую для типа клеток локализацию белков путем введения белков с флуоресцентными метками и создания слияний клеток.