Электрофизиологические измерения от моли обонятельной системы

Общая цель следующего эксперимента — продемонстрировать простоту регистрации обонятельных ответов нервной системы насекомого. Это достигается путем фиксации живой моли и подключения электродов к антенне или отдельному нейрону для записи ответов, индуцированных одорантом. На первом этапе стеклянный электрод, заполненный физраствором, вводится в глаз в качестве заземления; на втором этапе в антенну зафиксированной моли вводится стеклянный электрод, заполненный физраствором, что позволяет регистрировать электрические ответы в виде антеннограммы для записи ответов единичных элементов обонятельного рецепторного нейрона.

Регистрирующий электрод вводится в основание сенсилла. Затем сигнал с антенны усиливается и подается на аналого-цифровой преобразователь для регистрации и сохранения сигналов. В результате регистрируется электрический сигнал в виде сигнала ЭАГ или спайка, демонстрирующий дозозависимые ответы, индуцированные одорантом.

Нами был разработан новый метод регистрации энтерограмм у зафиксированного живого мотылька вида Naval orange. Основным преимуществом данной методики является длительное сохранение жизнеспособности препарата, что позволяет использовать одну и ту же особь многократно для регистрации различных ответов, а также для записи ответов отдельных единиц от индивидуального сенсора антенны. Мы сосредоточились на виде Naval orange, поскольку он представляет собой важный сельскохозяйственный вредитель в Калифорнии.

Тем не менее, данный метод может быть использован и для других насекомых-вредителей, не только для решения фундаментальных вопросов функционирования органов обоняния, но и для разработки новых аттрактантов. В данном исследовании обонятельной системы мотылька в качестве объекта используется naval orange worm Ullo Ella.

Колонию насекомых содержат на диете из пшеничных отрубей в климатических камерах при температуре примерно 28 °C, относительной влажности воздуха около 75% и фотопериоде 16 часов света и 8 часов темноты. Для недавно вылупившихся мотыльков готовят контейнеры, помещая в пластиковый бокс до 10 слоев пропитанных водой бумажных полотенец. Ежедневно собирают вылетающих мотыльков, определяют их пол и переносят в пластиковый бокс. Бокс накрывают перфорированной крышкой для обеспечения циркуляции воздуха в целях подготовки к электрофизиологическим записям.

Сначала изготовьте держатель для мотылька, обрезав наконечник дозатора объемом 200 µL так, чтобы диаметр отверстия составлял около двух миллиметров. Для проведения ЭАГ или SSR выберите мотылька, прошедшего от двух до четырех дней после выхода из куколки. Поместите мотылька в наконечник дозатора с противоположного конца, используя кусочек увлажненной салфетки, и осторожно протолкните его к кончику наконечника.

Продолжайте проталкивать моль до тех пор, пока антенны и часть головы не выступят из кончика; иммобилизуйте открытую часть головы, покрыв её невысыхающей глиной, оставив открытыми антенны и небольшую часть одного глаза. Поместите препарат моли на платформу микроманипулятора электрограммы между двумя держателями электродов, используя стеклянные электроды с диаметром кончика менее one micron. Заполните электроды раствором Рингера Centum limb.

Глядя в микроскоп, введите один электрод в открытый участок глаза. Он будет служить референтным электродом. Следующим шагом является размещение регистрирующих электродов на антеннах.

Усики самца бабочки-морковницы состоят из множества сегментов, каждый из которых украшен большим количеством волоскоподобных структур. На вставке представлена микрофотография, полученная с помощью сканирующего электронного микроскопа, на которой детально показана илла для облегчения регистрации сигналов с усиков. Отрежьте один или два дистальных сегмента усиков.

Затем вставьте обе антенны в регистрирующий электрод. В качестве альтернативы для регистрации сигналов от одного сенсилла введите регистрирующий электрод в основание сенсилла. Потенциалы действия от сенсилл усиливаются высокоимпедансным предусилителем и подаются на интеллектуальный цифро-аналоговый преобразователь USB для последующего анализа в автономном режиме с помощью программного обеспечения AutoSpike.

Следующим шагом является приготовление химического стимула с использованием ZZ 1113 HEXA deca Now, который является основным компонентом смеси феромонов самки naval orange worm; разбавьте вещество гексаном для получения DIC-разведений. Нанесите 10 µL раствора стимула на фильтровальную бумагу Watman. Испарите растворитель, аккуратно встряхивая бумагу в течение 10 секунд.

В вытяжном шкафу поместите полоску в полипропиленовый шприц объемом 5 мл; в качестве контролей подготовки используйте только гексан и пустой шприц. EAG или SSR фиксируют в увлажненном потоке воздуха, подаваемом контроллером стимулов со скоростью 20 мл/с. Подсоедините шприц с химическим стимулом к контроллеру воздушного потока.

Запишите базовые электрические сигналы в течение двух секунд. Затем подайте в поток воздуха стимулирующий импульс со скоростью 4 мл/с продолжительностью 500 мс. Продолжайте запись электрических сигналов еще в течение восьми секунд.

Сделайте перерыв не менее одной минуты между стимуляциями. На данном рисунке показан выраженный дозозависимый ответ антенн зафиксированного самца мотылька при стимуляции компонентом феромона самки, CZ 1113 hexaco.

Реакция на гексан. Контроль растворителем показан синей линией. Более высокие дозы феромона вызывают последовательно более выраженные записи электрограмм.

На этом рисунке представлены записи внеклеточных одиночных нейронов трихома в ответ на стимуляцию компонентом феромона самки. Эти записи демонстрируют дозозависимый возбуждающий ответ. После освоения данной методики ее выполнение при правильном подходе занимает несколько часов.

При использовании данного метода необходимо избегать контаминации и использовать максимально чистые химические реагенты.