Электрофизиологические измерения от моли обонятельной системы

Общая цель следующего эксперимента — продемонстрировать простоту записи обонятельных ответов нервной системы насекомого. Это достигается путем фиксации живой моли и подключения электродов к антенне или отдельному нейрону для регистрации ответов, индуцированных одорантом. На первом этапе стеклянный электрод, заполненный физиологическим раствором, вводится в глаз в качестве заземления; на втором этапе в антенну любой из зафиксированных молей вводится стеклянный электрод, заполненный физиологическим раствором, что позволяет регистрировать электрические ответы в виде антеннограммы для записи ответов одиночных единиц обонятельного рецепторного нейрона.

Регистрирующий электрод вводится в основание сэнуса. Затем сигнал с антенны усиливается и подается на аналого-цифровой преобразователь для записи и сохранения сигналов. В результате регистрируется электрический сигнал в виде сигнала ЭАГ или спайка, который демонстрирует дозозависимые ответы, индуцированные одорантом.

Нами был разработан новый метод регистрации энтерограммы у зафиксированной живой моли из вида Naval orange. Основным преимуществом данной методики является длительное сохранение жизнеспособности препарата, что позволяет многократно использовать одну и ту же особь для записи нескольких ответов, а также для регистрации ответов отдельных нейронов (single unit responses) от конкретного сенсора антенны. Мы сосредоточились на виде Naval orange, так как он представляет собой важный сельскохозяйственный вредитель в Калифорнии.

Тем не менее, этот метод может быть использован и для других насекомых-вредителей, не только для решения фундаментальных вопросов функционирования органов обоняния, но и для разработки новых аттрактантов. В данном исследовании обонятельной системы моли используется naval orange worm. Ullo Ella.

Колония насекомых содержится на диете из пшеничных отрубей в климатических камерах при температуре примерно 28 °C, относительной влажности воздуха около 75% и фоторежиме 16 часов света к 8 часам темноты. Для недавно появившихся мотыльков подготовьте контейнеры, поместив в пластиковый бокс до 10 слоев пропитанных водой бумажных полотенец. Ежедневно собирайте вылетающих мотыльков, определяйте их пол и переносите их в пластиковый бокс. Накройте бокс перфорированной крышкой для обеспечения циркуляции воздуха перед проведением электрофизиологических записей.

Сначала изготовьте держатель для моли, отрезав кончик наконечника дозатора объемом 200 µL так, чтобы диаметр отверстия составлял около двух миллиметров. Для ЭАГ или SSR выберите моль, находящуюся на второй–четвертой день после выхода из куколки. С помощью смоченного водой кусочка бумажной салфетки поместите моль в наконечник с противоположного от кончика конца, осторожно проталкивая насекомое в сторону кончика наконечника.

Продолжайте проталкивать моль до тех пор, пока антенны и часть головы не выступят из кончика; иммобилизируйте выступающую часть головы, покрыв её невысыхающей глиной, оставив открытыми антенны и небольшую часть одного глаза. Поместите препарат моли на платформу микроманипулятора электрограммы между двумя держателями электродов, используя стеклянные электроды с диаметром кончика менее 1 мкм. Заполните электроды раствором Рингера для конечностей centum.

Глядя в микроскоп, проколите один электрод в открытую область глаза. Он будет служить референтным электродом. Следующим шагом является установка регистрирующих электродов на антенны.

Усики самца морской оранжевой моли состоят из множества сегментов, каждый из которых украшен большим количеством волоскоподобных структур. Илла; на вставке представлена микрофотография, полученная с помощью сканирующего электронного микроскопа, с детальным изображением илл для облегчения регистрации сигналов с усиков. Отрежьте один или два дистальных сегмента усиков.

Затем введите обе антенны в регистрирующий электрод. В качестве альтернативы, для регистрации сигналов с одной сенсиллы, введите регистрирующий электрод в основание сенсиллы. Потенциалы действия от сенсилл усиливаются высокоимпедансным предусилителем и подаются на интеллектуальный цифро-аналоговый преобразователь USB для последующего офлайн-анализа с помощью программного обеспечения Autospike.

Следующим этапом является подготовка химического стимула с использованием ZZ 1113 HEXA deca Now, который является основным компонентом смеси феромонов самки naval orange worm; разведите вещество гексаном для получения разведений DIC. Нанесите 10 µL раствора стимула на фильтровальную бумагу Watman. Удалите растворитель путем осторожного встряхивания в течение 10 секунд.

В вытяжном шкафу поместите полоску в полипропиленовый шприц объемом пять миллилитров; в качестве контролей подготовки используются только гексан и пустой шприц. EAG или SSR поддерживаются в увлажненном потоке воздуха, подаваемом контроллером стимулов со скоростью 20 миллилитров в секунду. Подсоедините шприц с химическим стимулом к контроллеру потока воздуха.

Запишите два секунды базовых электрических сигналов. Затем подайте в воздушный поток стимульный импульс расходом 4 мл/с в течение 500 мс. Продолжайте запись электрических сигналов еще восемь секунд.

Сделайте перерыв не менее одной минуты между стимуляциями. На данном рисунке показан выраженный дозозависимый ответ антенн зафиксированного самца моли при стимуляции компонентом феромона самки, CZ 1113 hexaco.

Реакция на гексан. Контроль растворителем показан синей линией. Более высокие дозы феромона вызывают последовательно более выраженные записи электрограмм.

На этом рисунке представлены внеклеточные регистрации отдельных нейронов трихома в ответ на стимуляцию компонентом женского феромона. Эти записи демонстрируют дозозависимый возбуждающий ответ. После освоения данной методики ее выполнение при правильном подходе занимает несколько часов.

При использовании данного метода следует избегать контаминации и использовать максимально чистые химические реактивы.