Name: Измерительный Caenorhabditis Элеганс Продолжительность жизни в 96-луночных микротитровальных (Видео) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 23 s
Description: Узнайте метод измерения продолжительности жизни Caenorhabditis elegans в 96-луночных пластинах для скрининга соединений, продлевающих жизнь. Этот протокол позволяет исследователям изучать механизмы старения.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Этот Протокол был изначально разработан на Фреда Хатчинсона онкологический научный центр в Сиэтле Xiaolan Е. и Майкл Petrascheck в лаборатории Линда Бак. Детальная версия выше был подготовлен, чтобы сделать всю процедуру доступны широкой общественности. Мы благодарим Кэрол Тейлор, Сара LeBoeuf и Энди Tomacelli для критически чтения протокола. Это рукописи # 2866 из исследовательского института Скриппса. Petrascheck Лаборатория финансируется программой Novartis ДСП.

<ol><li>Johnson, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+life-span+of+age-1+mutants+in+Caenorhabditis+elegans+and+lower+Gompertz+rate+of+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Increased life-span of age-1 mutants in Caenorhabditis elegans and lower Gompertz rate of aging.</a> Science. 249, 908-912 (1990).</li>
<li>Kenyon, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The genetics of ageing.</a> Nature. 464, 504-512 (2010).</li>
<li>Finch, C. E., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genomics+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">The genetics of aging.</a> Annu Rev Genomics Hum Genet. 2, 435-462 (2001).</li>
<li>Wilson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blueberry+polyphenols+increase+lifespan+and+thermotolerance+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Blueberry polyphenols increase lifespan and thermotolerance in Caenorhabditis elegans.</a> Aging Cell. 5, 59-68 (2006).</li>
<li>Evason, K., Huang, C., Yamben, I., Covey, D. F., Kornfeld, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anticonvulsant+medications+extend+worm+life-span%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Anticonvulsant medications extend worm life-span.</a> Science. 307, 258-262 (2005).</li>
<li>McColl, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacogenetic+analysis+of+lithium-induced+delayed+aging+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Pharmacogenetic analysis of lithium-induced delayed aging in Caenorhabditis elegans.</a> J. Biol. Chem. 283, 350-357 (2008).</li>
<li>Petrascheck, M., Ye, X., Buck, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+antidepressant+that+extends+lifespan+in+adult+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An antidepressant that extends lifespan in adult Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 450, 553-556 (2007).</li>
<li>Srivastava, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reserpine+can+confer+stress+tolerance+and+lifespan+extension+in+the+nematode+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Biogerontology%22%5BJournal%5D)">Reserpine can confer stress tolerance and lifespan extension in the nematode C. elegans.</a> Biogerontology. 9, 309-316 (2008).</li>
<li>Wood, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sirtuin+activators+mimic+caloric+restriction+and+delay+ageing+in+metazoans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Sirtuin activators mimic caloric restriction and delay ageing in metazoans.</a> Nature. 430, 686-689 (2004).</li>
<li>Evason, K., Collins, J. J., Huang, C., Hughes, S., Kornfeld, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Valproic+acid+extends+Caenorhabditis+elegans+lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Valproic acid extends Caenorhabditis elegans lifespan.</a> Aging Cell. 7, 305-317 (2008).</li>
<li>Onken, B., Driscoll, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metformin+induces+a+dietary+restriction-like+state+and+the+oxidative+stress+response+to+extend+C.+elegans+Healthspan+via+AMPK%2C+LKB1%2C+and+SKN-1%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Metformin induces a dietary restriction-like state and the oxidative stress response to extend C. elegans Healthspan via AMPK, LKB1, and SKN-1.</a> PLoS One. 5, e8758-e8758 (2010).</li>
<li>Wu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ginkgo+biloba+extract+EGb+761+increases+stress+resistance+and+extends+life+span+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Biol+%28Noisy-le-grand%29%22%5BJournal%5D)">Ginkgo biloba extract EGb 761 increases stress resistance and extends life span of Caenorhabditis elegans.</a> Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 48, 725-731 (2002).</li>
<li>Kang, H. L., Benzer, S., Min, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+extension+in+Drosophila+by+feeding+a+drug%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Life extension in Drosophila by feeding a drug.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 838-843 (2002).</li>
<li>Avanesian, A., Khodayari, B., Felgner, J. S., Jafari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lamotrigine+extends+lifespan+but+compromises+health+span+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Biogerontology%22%5BJournal%5D)">Lamotrigine extends lifespan but compromises health span in Drosophila melanogaster.</a> Biogerontology. 11, 45-52 (2010).</li>
<li>Melov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extension+of+life-span+with+superoxide+dismutase%2Fcatalase+mimetics%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Extension of life-span with superoxide dismutase/catalase mimetics.</a> Science. 289, 1567-1569 (2000).</li>
<li>Benedetti, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compounds+that+confer+thermal+stress+resistance+and+extended+lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Gerontol%22%5BJournal%5D)">Compounds that confer thermal stress resistance and extended lifespan.</a> Exp. Gerontol. 43, 882-891 (2008).</li>
<li>Braungart, E., Gerlach, M., Riederer, P., Baumeister, R., Hoener, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+MPP%2B+model+of+Parkinson%27s+disease+for+high-throughput+drug+screenings%5BTitle%5D)+AND+%22Neurodegener+Dis%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans MPP+ model of Parkinson's disease for high-throughput drug screenings.</a> Neurodegener Dis. 1, 175-183 (2004).</li>
<li>Kwok, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small-molecule+screen+in+C.+elegans+yields+a+new+calcium+channel+antagonist%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A small-molecule screen in C. elegans yields a new calcium channel antagonist.</a> Nature. 441, 91-95 (2006).</li>
<li>Moy, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screen+for+novel+antimicrobials+using+a+whole+animal+infection+model%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">High-throughput screen for novel antimicrobials using a whole animal infection model.</a> ACS Chem Biol. 4, 527-533 (2009).</li>
<li>Kaletta, T., Hengartner, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Finding+function+in+novel+targets%3A+C.+elegans+as+a+model+organism%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Finding function in novel targets: C. elegans as a model organism.</a> Nat Rev Drug Discov. 5, 387-398 (2006).</li>
<li>Chung, C. T., Niemela, S. L., Miller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+preparation+of+competent+Escherichia+coli%3A+transformation+and+storage+of+bacterial+cells+in+the+same+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">One-step preparation of competent Escherichia coli: transformation and storage of bacterial cells in the same solution.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86, 2172-2175 (1989).</li>
<li>Klass, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%3A+major+biological+and+environmental+factors+influencing+life+span%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">Aging in the nematode Caenorhabditis elegans: major biological and environmental factors influencing life span.</a> Mech. Ageing Dev. 6, 413-429 (1977).</li>
<li>Ailion, M., Inoue, T., Weaver, C. I., Holdcraft, R. W., Thomas, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurosecretory+control+of+aging+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Neurosecretory control of aging in Caenorhabditis elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 7394-7397 (1999).</li>
<li>Kenyon, C., Chang, J., Gensch, E., Rudner, A., Tabtiang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+C.+elegans+mutant+that+lives+twice+as+long+as+wild+type%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A C. elegans mutant that lives twice as long as wild type.</a> Nature. 366, 461-464 (1993).</li>
<li>Lakowski, B., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+life-span+in+Caenorhabditis+elegans+by+four+clock+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Determination of life-span in Caenorhabditis elegans by four clock genes.</a> Science. 272, 1010-1013 (1996).</li>
</ol>

Нет конфликта интересов объявлены.

Протокол представлен позволяет измерять C.elegans продолжительность жизни в 96-луночных микротитровальных. Как показано в разделе репрезентативные результаты он надежно повторяет предыдущие выводы и предоставляет количественную информацию. С помощью этого анализа мы успешно экранированный более 89000 молекул для их влияние на C.elegans продолжительность жизни. В целях наркотиков скрининга, измерения продолжительности жизни в 96 формате планшет имеет ряд преимуществ перед классическим твердым анализа СМИ. Это снижает трудоемкость подготовки СМИ, сумма инкубации пространстве, и количество препарата требуется. 96-луночного формата и микроскопии установки позволяют автоматизацию всего тест для высокой пропускной показы. В ходе разработки анализа нескольких значений для каждой переменной и их комбинации были проверены на их воздействие на C.elegans продолжительность жизни. Эти тесты включали различные OP50 концентрации от 3 до 10 мг / мл (3, 4, 6, 8, 10 мг / мл), разное количество червей на лунку от 7 до 45 (7, 10, 15, 22, 45 черви / лунку), разные объемы культуры от 40 до 150 мкл на лунку (40, 60, 80, 100, 120, 150 мкл), а также изменения в буфере состава. Если кормить Карбенициллин устойчивые OP50, ни Карбенициллин ни Амфотерицин в концентрациях указанных оказались влияют C.elegans продолжительность жизни. Непрерывная осторожном встряхивании пластин, как это часто рекомендуется в C.elegans жидкой культуры, была найдена необязательной для небольших объемов, используемых в этом анализе. Нежный встряхивая, однако, требуется, если микротитровальных пластин с большим скважин, которые будут использоваться. Значений, указанных в данном протоколе, были тщательно отобраны на основе статистического сравнения различных условий испытания. Наиболее удивительная особенность этого анализа, вероятно, тот факт, что C.elegans может храниться в 96-луночных, которые запечатаны с лентой. Бок-о-бок сравнения не выявили никакой разницы в продолжительности жизни животных культивировали в распечатал плит, в виде пластин запечатанный пластиковый герметик, или в виде пластин запечатанный герметиков, которые позволяют воздухообмена. Во всех трех условий, животные развивались очень однородно из L1 для беременных взрослых в течение 65 часов и показали очень сопоставимы продолжительности жизни. Животные выросли параллельно на NGM разработали несколько быстрее, но эта разница не зависела от наличия или отсутствия герметика. Представлен протокол основан на живых бактерий, но могут быть адаптированы для мертвых бактерий. Однако, в жидком анализа одного выжить бактерии могут быстро размножаться и повторного заполнения культуры. В наших руках, единственный надежный способ уничтожения бактерий при условии, что они могут быть использованы для жидких культура является длительной обработки бактерий с гамма-облучения. Один важный момент необходимо учитывать при планировании эксперимента продолжительность жизни мощность обнаружения. В зависимости от размера эффекта, действие препарата заинтересованности должны быть испытаны в нескольких скважинах. В обычном анализе 4 наркотиков обращению и 4 контроль скважин, что соответствует примерно до 40-50 животных в каждой, должно хватить для обнаружения 30%-ное увеличение продолжительности жизни в более чем 95% от экспериментов. Увеличивает на 14% обнаруживаются только в 60% случаев и, следовательно, требует более повторить скважин. Огромное количество данных, продолжительность жизни, порожденная этим анализ может быть использован для разработки эксперимента или штамма параметрической модели Гомпертца 1. Эти Гомпертца модели полезны для определения мощности обнаружения и оценить количество ложных срабатываний и негативы для крупномасштабных экранов. Мы проверили предсказания этих моделей в слепой эксперименты и использовать их для оценки числа ложноотрицательных в больших экранов (неопубликованные результаты). Таким образом, мы ожидаем, что представлены анализ будет иметь большое использовать для идентификации малых молекул, которые расширяют продолжительность жизни C.elegans и изучить основные механизмы.

A correction to the article Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates was made.

Erratum: Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

<table><tbody><tr><td>Амфотерицин B</td><td>Calbiochem</td><td>cat# 171375</td><td>Также известен как Fungizone</td></tr><tr><td>FUDR</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>cat# F0503</td><td>FUDR инактивируется при нагревании, размораживать в холодной воде</td></tr><tr><td>Миансерин</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2525-250MG</td><td>Использовать в качестве положительного контроля при конечной концентрации 50&amp;#x03BC;M</td></tr><tr><td>Ципрогептадин</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>cat#C6022-MG</td><td>Альтернативный положительный контроль при конечной концентрации 10 &amp;#x03BC;M</td></tr><tr><td>Герметизирующая лента</td><td>Nalge Nunc international</td><td>cat# 236370</td><td>Полиэстер, нестерильная</td></tr><tr><td>96-луночный планшет</td><td>Falcon BD</td><td>cat# 351172</td><td>Необработанный, прозрачный, стерильный в индивидуальной упаковке, полистирол</td></tr><tr><td>Флакон Nunclon</td><td>Nalge Nunc international</td><td>cat# 178883</td><td>используется для больших объемов</td></tr></tbody></table>

Измерительный caenorhabditis Элеганс Продолжительность жизни в 96-луночных микротитровальных

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Продолжительность жизни является биологический процесс регулируется несколькими генетическими путями. Одна из стратегий для исследования биологии старения является изучение животных, которые укрывают мутации в компонентах возрастных нормативных путей. Если эти мутации возмущать зависимости от возраста-регуляторные пути и, следовательно, изменить продолжительность жизни всего организма, они обеспечивают важные механистического понимания 1-3. Еще одна стратегия для расследования регулирование продолжительности жизни заключается в использовании небольших молекул, отвечающих за нарушение возрастных нормативных путей. На сегодняшний день, число молекул, как известно, увеличить продолжительность жизни в различных модельных организмов и используются в качестве инструмента для изучения биологии старения 4-16. Число молекул, установленные на данный момент мало по сравнению с генетическим &quot;набор инструментов&quot;, которая доступна для изучения биологии старения. Caenorhabditis Элеганс является одним из основных моделей, используемых для изучения старения из-за своей отличной генетикой и короткой продолжительности жизни на три недели. Совсем недавно C.elegans стала модель организма для фенотипа основан экраны наркотиков 5,7,16-20 из-за ее небольшого размера и ее способности расти в микротитровальных пластин. Здесь мы представляем анализ для измерения C.elegans продолжительность жизни в 96-луночных микротитровальных. Анализ был разработан и успешно используется для выявления крупных библиотек для молекул, которые простираются C.elegans жизни 7. Надежность анализа была оценена в несколько тестов: во-первых, путем измерения продолжительности жизни диких животных, типа, выращенных при различных температурах, во-вторых, путем измерения продолжительности жизни мутантов с измененными продолжительность жизни, в-третьих, путем измерения изменений в продолжительности жизни в ответ на различные концентрации из антидепрессант Mirtazepine. Mirtazepine Ранее было показано, чтобы увеличить продолжительность жизни в C.elegans 7. Результаты этих тестов показывают, что анализ может повторить предыдущие результаты других анализов и носит количественный характер. Микротитровальных формат также делает этот анализ продолжительности жизни совместима с автоматизированными системами обработки жидких и позволяет интегрировать в автоматизированные платформы.

В этом протоколе мы представляем метод измерения<em&gt; Caenorhabditis Элеганс</em&gt; Продолжительность жизни в 96-луночных микротитровальных.

Измерительный Caenorhabditis Элеганс Продолжительность жизни в 96-луночных микротитровальных

Продолжительность жизни представляет собой биологический процесс, регулируемый несколькими генетическими путями. Одной из стратегий изучения биологии старения является исследование животных, обладающих...

Общая цель данной процедуры — измерение продолжительности жизни червей Caenorhabditis elegans, подвергнутых воздействию исследуемых препаратов. Для этого сначала подготавливают OP 50, бактериальный штамм, используемый для кормления червей. Затем создается возрастная синхронизированная популяция червей, которая высевается в 96-луночные планшеты вместе с кормовыми бактериями OP 50.В течение следующих двух дней черви развиваются до четвертой личиночной стадии (L4), и для предотвращения размножения добавляется препарат FUDR. На следующий день черви достигают взрослого состояния, после чего в отдельные лунки добавляются исследуемые препараты. С этого момента каждые два-три дня определяют количество живых и погибших червей до тех пор, пока все особи не погибнут.Наблюдение проводится с помощью инвертированного микроскопа, и в каждой сессии фиксируется количество живых и погибших червей. Здравствуйте, я Грег Солис. Я работаю в лаборатории Петро на кафедре химической физиологии в Исследовательском институте Скриппса.Сегодня я покажу вам, как синхронизировать червей и распределить их по 96-луночным микропланшетам. Основное преимущество этой методики перед существующими способами заключается в том, что она позволяет быстро идентифицировать молекулы, продлевающие продолжительность жизни C. elegans. Итак, приступим.Для подготовки бактерий для кормления C. elegans начните за семь дней до эксперимента, инокулировав 5 мл среды TB, содержащей 100 мкг/мл карбенициллина и 0,1 мкг/мл кантемицина B, одной колонией OP50. Инкубируйте культуру в бактериальном шейкере в течение ночи при 37 °C. Ранним утром следующего дня разведите ночную культуру OP50 в 300 мл среды TB, содержащей 50 мкг/мл ампициллина. Инкубируйте культуру в бактериальном шейкере от 8 до 12 часов при 37 °C до достижения насыщения. Не допускайте роста культуры более 14 часов.Перенесите OP 50 в стерильную предварительно взвешенную центрифужную пробирку. Осадите OP 50 путем центрифугирования в течение 10 минут при 3 500 RPM или 2 200 ×g в настольной центрифуге. Удалите супернатант, ресуспендируйте осадок OP 50 в стерильной воде и повторно осадите путем центрифугирования. Повторите эту процедуру промывки дважды, после второго раза.Осторожно промойте и полностью удалите всю оставшуюся воду. Взвесьте центрифужную пробирку с осадком и вычтите вес пустой центрифужной пробирки, чтобы определить массу осадка. Затем тщательно ресуспендируйте осадок в S Complete до концентрации 100 mg/mL.Слипшиеся комки должны отсутствовать. Концентрация OP 50, равная 100 mg/mL, должна соответствовать 2 × 10¹⁰ бактерий на мл. Используйте фотометр для определения количества бактерий на мл, если известна зависимость между оптической плотностью и количеством бактерий на мл.При необходимости доведите концентрацию питательного раствора OP 50 до 2 × 10¹⁰ бактерий на мл. В завершение храните раствор OP 50 при температуре 4 °C до момента использования для культуры червей с целью получения возрастной синхронной популяции. Начиная с вечера шестого дня до начала эксперимента (день -6), используйте чашку с NGM, возраст которой составляет от 5 до 10 дней, где популяция червей состоит преимущественно из голодающих личинок стадии L1.Стерилизуйте металлический шпатель, ненадолго нагрев его над горелкой Бунзена. Дайте ему остыть. Затем с помощью остывшего шпателя вырежьте кусочки агара из чашки с голодающими червями.Перенесите несколько таких фрагментов на новую чашку NGM диаметром 10 см с посевом OP 50. Инкубируйте червей примерно 65 часов при 20 °C, пока большая часть популяции не достигнет стадии взрослых особей (grave adults). Время, необходимое для роста голодающих личинок стадии L1 до взрослых особей, может варьироваться в зависимости от штамма.После инкубации соберите червей с чашки диаметром 10 сантиметров, смыв их с поверхности пятью–десятью миллилитрами стерильной воды. Перенесите полученный раствор с червями в коническую пробирку объемом 15 миллилилитров. Промойте червей, центрифугируя их в течение двух минут в настольной центрифуге при 1 200 RPM или 280 ×g. Удалите супернатант и добавьте 10 миллилитров воды.Повторите этап промывки, удалите супернатант и добавьте пять миллилитров свежеприготовленного раствора гипохлорита натрия. Инкубируйте раствор гидроксида натрия в течение пяти минут при RT до разрушения тел червей. Обязательно осторожно перемешивайте смесь на вортексе каждую минуту.Следите за ходом реакции под стереомикроскопом сразу после того, как все взрослые особи растворятся. Добавьте пять миллилитров буфера M nine для нейтрализации реакции. Промойте яйца трижды 10 миллилитрами буфера M nine, центрифугируя в течение двух минут при 2 500 об/мин или 1 100 ×g. Затем однократно промойте яйца 10 миллилитрами среды S complete, центрифугируя в течение двух минут при 2 500 об/мин или 1 100 ×g. Удалите супернатант.Добавьте 10 миллилитров среды S complete и перенесите раствор в новую коническую пробирку объемом 50 миллилитров. Добавьте 30 миллилитров среды S complete до достижения конечного объема 40 миллилитров. Осторожно встряхивайте пробирку в течение ночи при комнатной температуре на мутаторе или аналогичном устройстве, чтобы на следующий день около полудня пересеять культуру на чашки с животными.Под стереомикроскопом проверьте, вылупились ли черви за ночь. Определите концентрацию червей в полном растворе S, подсчитав количество червей в каплях объемом 10 µL. С помощью стереомикроскопа отсчитайте не менее 10 капель для каждого образца.Resus.Приготовьте суспензию червей с концентрацией от 80 до 100 особей на миллилитр. В полную среду S добавьте карбенициллин до конечной концентрации 50 µg/mL и амфотерицин B до конечной концентрации 0.1 µg/mL. Перемешайте на шейкере.При подготовке большего количества червей используйте колбу без клонирования объемом 600 миллилитров с фильтрующей крышкой. В 14:30 добавьте OP 50, приготовленный в первой части, до конечной концентрации 6 мг/мл. Верните OP 50 при температуре 4 °C. Перенесите 120 мкл раствора червей с OP 50 в каждую лунку 96-луночного планшета с прозрачным дном.Убедитесь, что черви остаются в суспензии во время дозирования пипеткой; загерметизируйте планшет с помощью ленты-герметика, чтобы избежать контаминации и испарения. Встряхните планшет на шейкере для микротитровальных планшетов в течение двух минут и инкубируйте в течение двух дней при 20 °C, пока животные не достигнут стадии L4. Затем для стерилизации животных добавьте по 30 µL стокового раствора FUDR с концентрацией 0,6 мМ в каждую лунку.На этом этапе конечный объем в каждой лунке доводится до 150 µL, а конечная концентрация OP 50 снижается с 6 mg/mL до 5 mg/mL. Герметизируйте планшет с помощью sealing-ленты и перемешивайте его в течение двух-трех минут на шейкере для микропланшетов. Если OP 50 были добавлены в 2:30 на второй день до начала эксперимента (day minus two), важно добавить FUDR до полудня; верните планшеты в инкубатор при 20 °C к 9:00 утра следующего дня.Большинство животных должны быть взрослыми и содержать несколько яиц. К каждой группе добавьте препараты, влияние которых на продолжительность жизни необходимо протестировать, в желаемой концентрации. При растворении препаратов в DMSO конечная концентрация DMSO не должна превышать 0.6%, так как концентрации DMSO выше 0.6% сокращают продолжительность жизни C. elegans после добавления препарата.Загерметизируйте планшеты с помощью ленты-герметика и встряхивайте их в течение двух-трех минут на шейкере для микротитрационных планшетов. Верните планшеты в инкубатор при температуре 20 °C. Добавление препаратов может иногда привести к гибели нескольких животных на планшет, особенно при использовании растворителя, отличного от воды.Используйте инвертиционный микроскоп, чтобы проверить наличие погибших животных. Как правило, на планшете с 96 лунками должно быть менее 10 погибших особей. Верните планшеты в инкубатор при температуре 20 °C на два дня, чтобы обеспечить доступ свежего кислорода в культуру. Снимите герметизирующую пленку.Подождите одну минуту и снова запечатайте планшет. Встряхивайте планшет в течение двух-трех минут на микропланшетном шейкере; повторяйте процедуру раз в неделю на пятый день жизни взрослых особей, добавляя в каждую из 96 лунок по 5 µL ранее приготовленного раствора OP 50 в концентрации 100 mg/mL для предотвращения голодания. Определение продолжительности жизни червей проводится по их подвижности три раза в неделю с начала эксперимента и до момента их гибели.Используйте инвертированный микроскоп с объективом 2х или 2,5х, чтобы осмотреть червей в 96-луночных планшетах в день 0 в начале эксперимента. Подсчитайте общее количество червей в каждой лунке.Лунки датчиков, содержащие более 18 особей из анализа, следует исключить, так как животным в таких лунках будет недостаточно OP 50, и в каждом сеансе подсчета будут проявляться эффекты пищевого ограничения. Записывайте дату и количество особей, которые двигаются, как живых животных. Передвижение в жидкости происходит гораздо легче, чем на твердых средах, и может быть спровоцировано сильным светом.Использование большего увеличения может помочь заметить очень слабые движения, например, в области кончика глотки. Такие едва заметные движения часто являются единственными наблюдаемыми движениями у очень старых животных. Верните планшеты в инкубатор при температуре 20 °C.Повторяйте сеансы подсчета каждые два-три дня до гибели всех животных. Ниже представлен образец таблицы Excel для записи данных о продолжительности жизни в каждой лунке. В ней указываются координаты лунки на планшете, линия животных, концентрация препарата, а также общее количество живых животных на нулевой день, зафиксированное в начале эксперимента.Трижды в неделю фиксируйте дату, а также количество живых и погибших особей, чтобы отслеживать выживаемость различных популяций в каждой лунке. На данном графике представлены кривые продолжительности жизни sea elegance, зарегистрированные при 20 °C и 25 °C. Анализ продолжительности жизни на базе микротитровальных планшетов точно воспроизводит температурно-зависимые изменения продолжительности жизни.Аналогичным образом, как показано здесь, анализ в микротитровальных планшетах воспроизводит изменения продолжительности жизни у мутантов, о которых сообщалось, что их продолжительность жизни отличается от животных дикого типа N two. На этом рисунке показано, как увеличение доз миртазапина влияет на среднюю продолжительность жизни sea elegance. Данные, полученные с помощью анализа в микротитровальных планшетах, являются достаточно количественными для определения зависимостей «доза-эффект». После освоения этот метод можно использовать для скрининга больших химических библиотек с целью поиска молекул, продлевающих продолжительность жизни see elegance.Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.

measuring-caenorhabditis-elegans-life-span-96-well-microtiter

Research

JoVE Journal

Biology

Биология

В этой статье мы представляем общий протокол для измерения продолжительности жизни нематод поддерживается на твердых средах с УФ-убил бактериальной пищи.

Измерительный Caenorhabditis Элеганс Продолжительность жизни на твердых средах

Это видео описывает традиционный метод измерения продолжительности жизни C. elegans с помощью пластин. В примере протокола измеряется продолжительность жизни червей, обработанных РНК-интерференцией.

Анализ продолжительности жизни: измерение долголетия C. elegans

Яйцо-в-червь (ЕНИ) анализ является полезным методом для количественной яйцекладки поведения. Изменения в откладки яиц может быть поведенческая реакция модельного...

Измерения воздействия бактерий на<em&gt; C. Элеганс</em&gt; Поведение использованием анализа Яйцо Сохранение

C. elegans является привлекательным модельным организмом для изучения путей передачи сигналов, участвующих в устойчивости к окислительному стрессу. Здесь мы приводим протокол измерения устойчивости к окислительному стрессу животных C. elegans в жидкой фазе с использованием нескольких окислителей в 96 луночных планшетах.

Измерение окислительного стрессоустойчивость<em&gt; Caenorhabditis Элеганс</em&gt; В микротитровальных пластинках 96-а

Основной протокол для оценки токсичности химических веществ в модель животного, Caenorhabditis elegans, описан. Метод является удобным и полезным для развития фармацевтических препаратов, а также для оценки риска различных загрязнителей окружающей среды.

Измерение воздействия химических веществ на рост и размножение Caenorhabditis elegans

Здесь мы опишем простой протокол для быстро производить сотни нематоды роста СМИ агар, 96-луночных культуры пластин с последовательным числом Caenorhhabditis elegans за хорошо. Эти культуры являются полезными для фенотипического скрининг всего организмов. Мы сосредоточимся на использование этих культур экрана химических веществ для про долговечность эффектов.

Простой метод для высокой пропускной способности химического скрининга в Caenorhabditis Elegans

Здесь мы описываем метод набора реплик, подход к количественной мерой C. elegans жизни/выживание и healthspan высокой пропускной способности и надежным образом, таким образом позволяя скрининг многих условий без ущерба для качества данных. Этот протокол подробности стратегии и представляет собой программное обеспечение инструмент для анализа данных набора реплик.

Метод Set реплики: Высок объём подход к количественной мерой Caenorhabditis elegans продолжительность жизни

Следующий протокол описывает разработку и оптимизацию высокопроизводительного рабочего процесса для культивирования червей, флуоресцентной визуализации и автоматизированной обработки изображений для количественной оценки агрегатов полиглутамина в качестве оценки изменений в протеостазе.

Автоматизация количественной оценки агрегатов в Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans служат отличной модельной системой с надежными и недорогими методами обследования продолжительности здоровья, продолжительности жизни и устойчивости к стрессу.

Исследование недорогих методов измерения продолжительности жизни и продолжительности здоровья у Caenorhabditis elegans

Здесь мы представляем общий метод определения эмбриональной жизнеспособности и общего количества эмбрионов, полученных (выводка) с использованием модельного организма C. elegans.

Измерение эмбриональной жизнеспособности и размера расплода у Caenorhabditis elegans

В этом протоколе описан анализ для количественной оценки скорости кормления Caenorhabditis elegans на основе измерения клиренса бактерий в жидкой культуре.

Количественная оценка потребления пищи при Caenorhabditis elegans путем измерения бактериального клиренса

Узнайте метод измерения продолжительности жизни Caenorhabditis elegans в 96-луночных пластинах для скрининга соединений, продлевающих жизнь. Этот протокол позволяет исследователям изучать механизмы старения.

Измерительный Caenorhabditis Элеганс Продолжительность жизни в 96-луночных микротитровальных

Больше видео