Измерительный Caenorhabditis Элеганс Продолжительность жизни в 96-луночных микротитровальных

Общая цель этой процедуры заключается в том, чтобы измерить продолжительность жизни морских червей Элгана, которые были обработаны препаратами, представляющими интерес. Это достигается путем предварительного приготовления бактериального штамма OP 50, который используется для кормления червей. Затем генерируется синхронизированная по возрасту популяция червей, которая засевается в 96 луночных планшетов вместе с кормящими бактериями OP 50.

В течение следующих двух дней черви вырастают до личиночной стадии L и добавляют препарат FUDR для предотвращения размножения. На следующий день черви достигают зрелого возраста, и в отдельные лунки добавляются интересующие их препараты. С этого момента количество живых и мертвых червей определяется каждые два-три дня до тех пор, пока все черви не умрут.

Наблюдение проводится с помощью перевернутого микроскопа, и количество мертвых и живых червей регистрируется в каждом сеансе. Привет, я Грег Солис. Я работаю в лаборатории Петро на кафедре химической физиологии в Научно-исследовательском институте Скриппса.

Сегодня я покажу вам, как синхронизировать червей и распределить их по 96 стеночным микротитровым пластинам. Основное преимущество этой техники из существующих методов заключается в том, что она позволяет быстро идентифицировать молекулы, которые продлевают срок службы и обладают элегантностью C. Итак, приступим.

Для приготовления кормления бактерий для C elegance начните с седьмого дня с инокуляции пяти миллилитров TB, содержащего 100 микрограмм на миллилитр и персин, и 0,1 микрограмма на миллилитр и терина B с одной колонии OP 50, инкубируйте в течение ночи при 37 градусах Цельсия в бактериальном шейкере рано утром следующего дня, разведите за ночь культуру OP 51 в 2000 году в 300 миллилитрах TB, содержащем 50 микрограммов на миллилитр ампициллина. Инкубируйте культуру в бактериальном шейкере в течение восьми-12 часов при температуре 37 градусов Цельсия до тех пор, пока не будет достигнуто насыщение. Не допускайте роста культуры дольше 14 часов.

Переложите OP 50 в стерильную предварительно взвешенную центрифужную пробирку Гранулируйте OP 50 центрифугированием в течение 10 минут при 3 500 об/мин или 2, 200 раз G в настольной центрифуге. Выбросьте надосадочную жидкость S, повторно суспендируйте гранулу OP 50 и обведите нашу воду и повторите гранулу центрифугированием. Повторите это, постирайте два раза после второго.

Тщательно промойте и тщательно удалите всю оставшуюся воду. Взвесьте центрифужную трубку, содержащую гранулу, и вычтите вес пустой центрифужной трубки, чтобы определить вес гранулы. Далее тщательно суспендируйте гранулу в S Complete до концентрации 100 миллиграмм на миллилитр.

Никаких комочков не должно оставаться. Концентрация 100 миллиграмм на миллилитр ОП 50 должна соответствовать от двух до 10 бактерий на миллилитр. Используйте фотоспектрометр для определения количества бактерий на миллилитр, если известна взаимосвязь между оптической плотностью и количеством бактерий на миллилитр

При необходимости отрегулируйте концентрацию питательного раствора ОП 50 в два раза по 10 до 10 бактерий на миллилитр. Наконец, храните раствор OP 50 при температуре четыре градуса Цельсия до тех пор, пока он не будет использован для культивирования червей для создания популяции червей с синхронным возрастом. Начните поздно вечером на день минус 6 с 5-10-дневной пластины NGM, на которой популяция червей состоит в основном из голодающих личинок Lone.

Простерилизуйте металлический шпатель, кратковременно нагрев его над конфоркой Бунзена. Дайте остыть. Затем с помощью прохладной лопатки вырежьте кусочки агара из тарелки, содержащей голодных червей.

Переложите несколько таких кусков на свежую 10-сантиметровую пластину NGM, засеянную OP 50. Инкубируйте червей в течение примерно 65 часов при температуре 20 градусов Цельсия, пока большая часть популяции червей не будет состоять из взрослых особей. Время, необходимое для того, чтобы истощенные животные вырастали в серьезных взрослых особей, может варьироваться от штамма к штамму.

После инкубации соберите червей с 10-сантиметровой пластины, смыв их с тарелки пятью-10 миллилитрами стерильной воды. Перелейте водный раствор червя в коническую трубку объемом 15 миллилитров. Промойте червей центрифугированием в течение двух минут в настольной центрифуге при 1, 200 об/мин или 280 раз G. Выбросьте супинат и добавьте 10 миллилитров воды.

Повторите этап стирки, удалите натанг SUP и добавьте пять миллилитров свежеприготовленного отбеливателя. Раствор гидроксида натрия инкубировать в течение пяти минут при РТ до тех пор, пока черви не раскроются. Обязательно делайте завихрения мягко каждую минуту.

Следите за ходом реакции под препарирующим микроскопом, как только все взрослые особи растворятся. Добавьте пять миллилитров М девяти буфера, чтобы нейтрализовать реакцию. Промойте яйца три раза 10 миллилитров буфера M 9, центрифугируя в течение двух минут при 2, 500 об/мин или 1, 100 раз G. Затем промойте яйца один раз 10 миллилитрами S в комплекте, центрифугируя в течение двух минут при 2 500 об/мин или 1, 100 раз G. Удалите сна.

Добавьте 10 миллилитров S в комплекте и перелейте раствор в свежую коническую трубку объемом 50 миллилитров. Добавьте 30 миллилитров S в сборе до конечного объема в 40 миллилитров. Осторожно встряхните пробирку в течение ночи при комнатной температуре на мутаторе или аналогичном устройстве, чтобы засеять животные пластины на следующий день около полудня.

Под эндоскопом для вскрытия проверьте, не вылупились ли черви за ночь. Определите концентрацию глистов в S полном растворе, подсчитав количество глистов в 10 микролах капель. С помощью препарирующего эндоскопа подсчитывайте не менее 10 капель для каждого образца. Ресус.

Суспензируйте червей в концентрации от 80 до 100 червей на миллилитр. В полную среду S добавляют карбенициллин до конечной концентрации 50 мкг на миллилитр и амфотерицин B до конечной концентрации 0,1 мкг на миллилитр. Встряхните на мутаторе.

Если вы готовите большое количество червей, используйте колбу объемом 600 миллилитров без клонирования с фильтрующей крышкой В 14:30 Добавьте OP 50, приготовленный в первой части, до конечной концентрации шесть миллиграммов на миллилитр. Верните OP 50 на четыре градуса Цельсия. Перелейте по 120 микролитров раствора червячка ОП 50 в каждую лунку 96-луночного планшета с прозрачным дном.

Убедитесь, что черви и суспензия сохранены во время пипетирования, запечатайте пластину с помощью ленточного герметика, чтобы избежать загрязнения и испарения. Встряхните тарелку на вибростенде для микротитров в течение двух минут и инкубируйте в течение двух дней при температуре 20 градусов Цельсия, пока животные не достигнут стадии L four. Далее для стерилизации животных добавьте в каждую лунку по 30 микролитров 0,6 миллимолярного раствора FUDR

На этом этапе конечный объем в каждой лунке доводится до 150 микролитров и снижается конечная концентрация OP 50 с шести миллиграммов на миллилитр до пяти миллиграммов на миллилитр. Запечатайте пластину с помощью ленточных запайщиков и встряхните ее в течение двух-трех минут на вибростенде для планшетов. Если OP 50 был добавлен в два часа 30 минут в день минус два, важно, чтобы FUDR был добавлен до полудня в инкубатор с температурой 20 градусов Цельсия к 9:00 утра следующего дня.

Большая часть животных должна быть серьезной и содержать несколько яиц. В каждый из них добавляют препараты, влияние которых на продолжительность жизни должно быть проверено при желаемой концентрации. При растворении препаратов в ДМСО конечные концентрации ДМСО не должны превышать 0,6%, так как концентрации ДМСО превышают 0,6%. Сократите продолжительность жизни элгана после добавления препарата.

Заклейте пластины скотчем и встряхните их в течение двух-трех минут на микротитровой пластине. Встряхивателем верните пластины в инкубатор с температурой 20 градусов Цельсия. Добавление лекарств иногда может убить несколько животных на тарелку, особенно при использовании растворителя, отличного от воды.

Используйте перевернутый микроскоп для проверки мертвых животных. Как правило, на 96 мировых тарелок должно приходиться менее 10 мертвых животных Верните пластины в инкубатор при температуре 20 градусов Цельсия на два дня, чтобы обеспечить поступление свежего кислорода в культуру. Снимите герметик.

Подождите одну минуту и снова закройте пластину. Встряхните пластину в течение двух-трех минут на более плотной пластине шейкера, повторяйте один раз в неделю на пятый день взрослой жизни, добавьте по пять микролитров из 100 мг на миллилитр раствора OP 50, который был приготовлен ранее, в каждую из 96 лунок для предотвращения голодания. Продолжительность жизни червей оценивается по их движению три раза в неделю с начала эксперимента до их смерти.

Используйте инвертированный микроскоп с объективом с двумя или 2,5-кратными увеличениями для наблюдения за червями в 96. Скважина планшетов на нулевой день в начале эксперимента. Посчитайте общее количество червей в каждой лунке.

Сенсорные лунки, которые содержат более 18 животных из анализа в качестве животных в этих лунках, не будут иметь достаточного ОП 50 и будут демонстрировать эффекты диетических ограничений при каждом сеансе учета. Запишите дату и количество животных, которые перемещаются как живые животные. Движение жидкости намного проще, чем на твердых средах, и может быть вызвано сильным светом.

Использование большего увеличения может помочь заметить очень тонкие движения, такие как на кончике глотки. Такие тонкие движения часто являются единственными движениями, наблюдаемыми у очень старых животных. Верните тарелки в инкубатор с температурой 20 градусов Цельсия.

Повторяйте сеансы подсчета каждые два-три дня, пока все животные не умрут. Это дизайн листа Excel для записи данных о сроке службы каждой скважины. Его координата в деформации пластины, концентрации препарата и общем количестве животных, живых на нулевой день, фиксируется в начале эксперимента.

Записывайте дату, а также количество живых и мертвых животных три раза в неделю, чтобы следить за выживанием различных популяций в каждой скважине. На этом рисунке показаны результаты морской элегантности, продолжительности жизни, кривых, зафиксированных при 20 градусах Цельсия и 25 градусах Цельсия. Анализ продолжительности жизни на основе микротитров точно воспроизводит изменения продолжительности жизни, зависящие от температуры.

Аналогичным образом, как показано здесь, анализ с помощью микротитровальной пластины воспроизводит изменения в продолжительности жизни мутантов, которые, как сообщается, имеют продолжительность жизни, отличающуюся от продолжительности жизни диких животных типа N два. На этом рисунке показано, как возрастающие дозы миртазапина влияют на среднюю продолжительность жизни морских элегантностей. Данные, полученные с помощью микротитровального планшета, являются достаточно количественными для определения зависимостей «доза-реакция» После освоения этот метод может быть использован для скрининга больших химических библиотек на наличие молекул, которые продлевают срок службы и выглядят элегантно.

Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.