Измерительный Caenorhabditis Элеганс Продолжительность жизни в 96-луночных микротитровальных

Общая цель данной процедуры — измерение продолжительности жизни червей Caenorhabditis elegans, подвергнутых воздействию исследуемых препаратов. Для этого сначала подготавливают OP 50, бактериальный штамм, используемый для кормления червей. Затем создается возрастная синхронизированная популяция червей, которая высевается в 96-луночные планшеты вместе с кормовыми бактериями OP 50.

В течение следующих двух дней черви развиваются до четвертой личиночной стадии (L4), и для предотвращения размножения добавляется препарат FUDR. На следующий день черви достигают взрослого состояния, после чего в отдельные лунки добавляются исследуемые препараты. С этого момента каждые два-три дня определяют количество живых и погибших червей до тех пор, пока все особи не погибнут.

Наблюдение проводится с помощью инвертированного микроскопа, и в каждой сессии фиксируется количество живых и погибших червей. Здравствуйте, я Грег Солис. Я работаю в лаборатории Петро на кафедре химической физиологии в Исследовательском институте Скриппса.

Сегодня я покажу вам, как синхронизировать червей и распределить их по 96-луночным микропланшетам. Основное преимущество этой методики перед существующими способами заключается в том, что она позволяет быстро идентифицировать молекулы, продлевающие продолжительность жизни C. elegans. Итак, приступим.

Для подготовки бактерий для кормления C. elegans начните за семь дней до эксперимента, инокулировав 5 мл среды TB, содержащей 100 мкг/мл карбенициллина и 0,1 мкг/мл кантемицина B, одной колонией OP50. Инкубируйте культуру в бактериальном шейкере в течение ночи при 37 °C. Ранним утром следующего дня разведите ночную культуру OP50 в 300 мл среды TB, содержащей 50 мкг/мл ампициллина. Инкубируйте культуру в бактериальном шейкере от 8 до 12 часов при 37 °C до достижения насыщения. Не допускайте роста культуры более 14 часов.

Перенесите OP 50 в стерильную предварительно взвешенную центрифужную пробирку. Осадите OP 50 путем центрифугирования в течение 10 минут при 3 500 RPM или 2 200 ×g в настольной центрифуге. Удалите супернатант, ресуспендируйте осадок OP 50 в стерильной воде и повторно осадите путем центрифугирования. Повторите эту процедуру промывки дважды, после второго раза.

Осторожно промойте и полностью удалите всю оставшуюся воду. Взвесьте центрифужную пробирку с осадком и вычтите вес пустой центрифужной пробирки, чтобы определить массу осадка. Затем тщательно ресуспендируйте осадок в S Complete до концентрации 100 mg/mL.

Слипшиеся комки должны отсутствовать. Концентрация OP 50, равная 100 mg/mL, должна соответствовать 2 × 10¹⁰ бактерий на мл. Используйте фотометр для определения количества бактерий на мл, если известна зависимость между оптической плотностью и количеством бактерий на мл.

При необходимости доведите концентрацию питательного раствора OP 50 до 2 × 10¹⁰ бактерий на мл. В завершение храните раствор OP 50 при температуре 4 °C до момента использования для культуры червей с целью получения возрастной синхронной популяции. Начиная с вечера шестого дня до начала эксперимента (день -6), используйте чашку с NGM, возраст которой составляет от 5 до 10 дней, где популяция червей состоит преимущественно из голодающих личинок стадии L1.

Стерилизуйте металлический шпатель, ненадолго нагрев его над горелкой Бунзена. Дайте ему остыть. Затем с помощью остывшего шпателя вырежьте кусочки агара из чашки с голодающими червями.

Перенесите несколько таких фрагментов на новую чашку NGM диаметром 10 см с посевом OP 50. Инкубируйте червей примерно 65 часов при 20 °C, пока большая часть популяции не достигнет стадии взрослых особей (grave adults). Время, необходимое для роста голодающих личинок стадии L1 до взрослых особей, может варьироваться в зависимости от штамма.

После инкубации соберите червей с чашки диаметром 10 сантиметров, смыв их с поверхности пятью–десятью миллилитрами стерильной воды. Перенесите полученный раствор с червями в коническую пробирку объемом 15 миллилилитров. Промойте червей, центрифугируя их в течение двух минут в настольной центрифуге при 1 200 RPM или 280 ×g. Удалите супернатант и добавьте 10 миллилитров воды.

Повторите этап промывки, удалите супернатант и добавьте пять миллилитров свежеприготовленного раствора гипохлорита натрия. Инкубируйте раствор гидроксида натрия в течение пяти минут при RT до разрушения тел червей. Обязательно осторожно перемешивайте смесь на вортексе каждую минуту.

Следите за ходом реакции под стереомикроскопом сразу после того, как все взрослые особи растворятся. Добавьте пять миллилитров буфера M nine для нейтрализации реакции. Промойте яйца трижды 10 миллилитрами буфера M nine, центрифугируя в течение двух минут при 2 500 об/мин или 1 100 ×g. Затем однократно промойте яйца 10 миллилитрами среды S complete, центрифугируя в течение двух минут при 2 500 об/мин или 1 100 ×g. Удалите супернатант.

Добавьте 10 миллилитров среды S complete и перенесите раствор в новую коническую пробирку объемом 50 миллилитров. Добавьте 30 миллилитров среды S complete до достижения конечного объема 40 миллилитров. Осторожно встряхивайте пробирку в течение ночи при комнатной температуре на мутаторе или аналогичном устройстве, чтобы на следующий день около полудня пересеять культуру на чашки с животными.

Под стереомикроскопом проверьте, вылупились ли черви за ночь. Определите концентрацию червей в полном растворе S, подсчитав количество червей в каплях объемом 10 µL. С помощью стереомикроскопа отсчитайте не менее 10 капель для каждого образца.Resus.

Приготовьте суспензию червей с концентрацией от 80 до 100 особей на миллилитр. В полную среду S добавьте карбенициллин до конечной концентрации 50 µg/mL и амфотерицин B до конечной концентрации 0.1 µg/mL. Перемешайте на шейкере.

При подготовке большего количества червей используйте колбу без клонирования объемом 600 миллилитров с фильтрующей крышкой. В 14:30 добавьте OP 50, приготовленный в первой части, до конечной концентрации 6 мг/мл. Верните OP 50 при температуре 4 °C. Перенесите 120 мкл раствора червей с OP 50 в каждую лунку 96-луночного планшета с прозрачным дном.

Убедитесь, что черви остаются в суспензии во время дозирования пипеткой; загерметизируйте планшет с помощью ленты-герметика, чтобы избежать контаминации и испарения. Встряхните планшет на шейкере для микротитровальных планшетов в течение двух минут и инкубируйте в течение двух дней при 20 °C, пока животные не достигнут стадии L4. Затем для стерилизации животных добавьте по 30 µL стокового раствора FUDR с концентрацией 0,6 мМ в каждую лунку.

На этом этапе конечный объем в каждой лунке доводится до 150 µL, а конечная концентрация OP 50 снижается с 6 mg/mL до 5 mg/mL. Герметизируйте планшет с помощью sealing-ленты и перемешивайте его в течение двух-трех минут на шейкере для микропланшетов. Если OP 50 были добавлены в 2:30 на второй день до начала эксперимента (day minus two), важно добавить FUDR до полудня; верните планшеты в инкубатор при 20 °C к 9:00 утра следующего дня.

Большинство животных должны быть взрослыми и содержать несколько яиц. К каждой группе добавьте препараты, влияние которых на продолжительность жизни необходимо протестировать, в желаемой концентрации. При растворении препаратов в DMSO конечная концентрация DMSO не должна превышать 0.6%, так как концентрации DMSO выше 0.6% сокращают продолжительность жизни C. elegans после добавления препарата.

Загерметизируйте планшеты с помощью ленты-герметика и встряхивайте их в течение двух-трех минут на шейкере для микротитрационных планшетов. Верните планшеты в инкубатор при температуре 20 °C. Добавление препаратов может иногда привести к гибели нескольких животных на планшет, особенно при использовании растворителя, отличного от воды.

Используйте инвертиционный микроскоп, чтобы проверить наличие погибших животных. Как правило, на планшете с 96 лунками должно быть менее 10 погибших особей. Верните планшеты в инкубатор при температуре 20 °C на два дня, чтобы обеспечить доступ свежего кислорода в культуру. Снимите герметизирующую пленку.

Подождите одну минуту и снова запечатайте планшет. Встряхивайте планшет в течение двух-трех минут на микропланшетном шейкере; повторяйте процедуру раз в неделю на пятый день жизни взрослых особей, добавляя в каждую из 96 лунок по 5 µL ранее приготовленного раствора OP 50 в концентрации 100 mg/mL для предотвращения голодания. Определение продолжительности жизни червей проводится по их подвижности три раза в неделю с начала эксперимента и до момента их гибели.

Используйте инвертированный микроскоп с объективом 2х или 2,5х, чтобы осмотреть червей в 96-луночных планшетах в день 0 в начале эксперимента. Подсчитайте общее количество червей в каждой лунке.

Лунки датчиков, содержащие более 18 особей из анализа, следует исключить, так как животным в таких лунках будет недостаточно OP 50, и в каждом сеансе подсчета будут проявляться эффекты пищевого ограничения. Записывайте дату и количество особей, которые двигаются, как живых животных. Передвижение в жидкости происходит гораздо легче, чем на твердых средах, и может быть спровоцировано сильным светом.

Использование большего увеличения может помочь заметить очень слабые движения, например, в области кончика глотки. Такие едва заметные движения часто являются единственными наблюдаемыми движениями у очень старых животных. Верните планшеты в инкубатор при температуре 20 °C.

Повторяйте сеансы подсчета каждые два-три дня до гибели всех животных. Ниже представлен образец таблицы Excel для записи данных о продолжительности жизни в каждой лунке. В ней указываются координаты лунки на планшете, линия животных, концентрация препарата, а также общее количество живых животных на нулевой день, зафиксированное в начале эксперимента.

Трижды в неделю фиксируйте дату, а также количество живых и погибших особей, чтобы отслеживать выживаемость различных популяций в каждой лунке. На данном графике представлены кривые продолжительности жизни sea elegance, зарегистрированные при 20 °C и 25 °C. Анализ продолжительности жизни на базе микротитровальных планшетов точно воспроизводит температурно-зависимые изменения продолжительности жизни.

Аналогичным образом, как показано здесь, анализ в микротитровальных планшетах воспроизводит изменения продолжительности жизни у мутантов, о которых сообщалось, что их продолжительность жизни отличается от животных дикого типа N two. На этом рисунке показано, как увеличение доз миртазапина влияет на среднюю продолжительность жизни sea elegance. Данные, полученные с помощью анализа в микротитровальных планшетах, являются достаточно количественными для определения зависимостей «доза-эффект». После освоения этот метод можно использовать для скрининга больших химических библиотек с целью поиска молекул, продлевающих продолжительность жизни see elegance.

Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.