Загрузка дрозофилы нервными окончаниями с кальцием Индикаторы

Здравствуйте, меня зовут Грег Маклеод. В моей лаборатории изучают регуляцию кальция в нервных терминалях и ее влияние на нейротрансмиссию. Мы проводим эти исследования на *Drosophila melanogaster*.

Плодовая мушка является привлекательной моделью для нейробиологов благодаря своей генетической пластичности и простой, доступной нервной системе. В этой нервной системе доступны генетически кодируемые флуоресцентные индикаторы для обнаружения изменений уровня кальция в нервных терминалях. Однако эти индикаторы обладают ограниченной чувствительностью к кальцию и часто демонстрируют нелинейный отклик.

Синтетические индикаторы лучше подходят для измерения быстрых изменений концентрации кальция, связанных с нервной активностью. Мы продемонстрируем метод введения конъюгированных с декстрином синтетических индикаторов кальция в живые нервные окончания личинок oph lava. Конъюгация с декстрином помогает предотвратить секвестрацию индикаторов кальция в органеллах, таких как митохондрии.

Данный метод загрузки может быть в равной степени применен к личинкам, эмбрионам и взрослым особям. Мы проведем диссекцию личинки в небольшом солевом растворе на предметном стекле. Синий стоматологический воск будет служить опорой для стеклянного загрузочного ложа.

Возьмите одну личинку из раствора star lava с края ненаселенного флакона. Поместите личинку в несколько капель охлажденного раствора Шнайдера и закрепите её булавками за голову и хвост, расположив спинную срединную линию сверху. С помощью острых микроножниц сделайте надрез.

Сделайте небольшой разрез между трахеями, достаточного размера, чтобы нижнее лезвие ножниц могло проникнуть внутрь. Разрежьте кутикулу вдоль дорсальной срединной линии между трахеями до самой головы. Поверните личинку на 180 градусов и продлите разрез до самого хвоста.

Важно следить за тем, чтобы нижнее лезвие не проникало слишком глубоко в внутренние органы, а ограничивалось личинкой, так как это может повредить мышцы и нервы, которые необходимо исследовать. Большая часть внутренних органов выйдет через разрез; сделайте надрез вдоль этого тракта рядом с хвостом, затем еще один надрез, и прорежьте нижележащую трахею на всем протяжении до самой головы. Повторите процедуру с другой стороны.

Удалите большую часть внутренностей, вырезав их и извлекая из ванночки. Отложите ножницы и возьмите второй пинцет. Захватите обрезанный край кутикулы и прижмите его к одной стороне.

Повторите процедуру для другой стороны. Перейдите на четыре сегмента вперед по направлению к голове и повторите процедуру. Удалите все оставшиеся внутренние органы на данном этапе. Убедитесь, что мышцы 7, 6, 13 или 12 не были повреждены ни в одном из сегментов.

Если какие-либо части были повреждены, препарируйте другую личинку, так как подобные повреждения неизбежно приводят к генным сокращениям, которые затруднят последующую визуализацию. На следующих этапах становятся видны полушария мозга, вентральный ганглий и сегментарные нервы. Мы поместим срез сегментарного нерва, выполненный под давлением, в стеклянную кювету FOP и с помощью пластиковой заполняющей нити нанесем индикатор кальция на открытый конец нерва.

Но для начала мы продемонстрируем, как изготовить нить для заполнения и создать эффект заполнения. Будет применен метод двухэтапного вытягивания: желтую бракованную заготовку медленно нагревают вдоль половины ее длины, пока пластик не станет мягким и прозрачным. На этом этапе нагрев прекращают и немедленно тянут за кончик, чтобы вытянуть его в тонкую нить.

Его диаметр составляет около 0,5 мм. Отрежьте нить длиной 50 мм. Теперь поместите нить под диссекционный микроскоп и закрепите срез.

Зажмите один конец ногтем, а затем потяните за другой конец, чтобы вытянуть тонкую нить длиной один сантиметр. Ее необходимо обрезать новым лезвием бритвы на салфетке из папиросной бумаги, чтобы избежать замятия концов, и сделать срез острым для последующего заполнения. Начните с тонкостенного капилляра без какой-либо нити.

Вытяните его в тонкий конусообразный кончик с помощью вытягивателя пипеток. Перенесите заготовку под диссекционный микроскоп и сделайте надрез на конусообразной части с помощью наждачной бумаги. Отогните кончик дистальнее надреза в сторону, противоположную месту надреза, чтобы кончик отломился ровно.

Внутренний диаметр разрыва должен быть больше внешнего диаметра. В конце заполняющего филамента используйте микрогорелку, чтобы подвергнуть разрыв термической усадке в стекле до тех пор, пока внутренний диаметр не достигнет примерно 12 microns. Используйте горелку Бунзена, чтобы отполировать тупой конец изделия.

Отрицательное давление можно приложить к тупому концу эффектора, используя плотно прилегающую кельтик-трубку, соединенную с жесткой полиэтиленовой трубкой и шприцем. Эта же трубка и шприц будут использоваться для забора и вытеснения индикатора кальция из филамента. Индикатор кальция следует растворить в дистиллированной воде до концентрации пять милли.

Разделите этот раствор на аликвоты по 5 µL. Храните их при температуре 4 °C. Не замораживайте данные аликвоты, чтобы они оставались в жидком состоянии до момента использования.

Теперь наберите в нить один-два сантиметра индикатора кальция; теперь вы готовы перейти к самому критическому этапу данной методики загрузки. С помощью ножниц и пинцета перережьте нервы самого переднего сегмента по отдельности, максимально близко к вентральным ганглиям. Самая передняя масса сегментарных нервов от вентрального желудочка.

Обрежьте все остатки тканей. Поместите наполняющую нить на наклонную плоскость из стоматологического воска так, чтобы кончик находился в центре личинки. Подсоедините scholastic-трубку и шприц.

Наберите небольшое количество раствора Шнайдера в наконечник Perfect. Затем поместите конец нерва в этот наконечник. Посадка должна быть плотной, но не слишком тугой.

Это должно предотвратить дальнейшее проникновение Schneiders в защитную зону. Обычно извлекают и scholastic tube, и шприц, после чего присоединяют их к F filament. Прикоснитесь краем filament к Schneiders в ванночке, чтобы снять статическое электричество, и немедленно введите filament gum effect на расстояние до 50 microns от места пересечения нерва, не касаясь его непосредственно.

Медленно введите индикатор кальция, чтобы увеличить объем раствора Шнайдера примерно на одну треть. Таким образом, конечная концентрация индикатора кальция составит чуть менее 2 мМ. Выдержите препарат в темном влажном месте при комнатной температуре около 40 минут. Здесь я хотел бы отметить два важных момента.

Сначала в кончике пипетки должен находиться физиологический раствор для разбавления индикатора кальция, так как индикатор кальция был растворен только в воде. Физиологический раствор должен содержать кальций в концентрации нескольких миллимолей, поскольку герметизация аксона является кальций-зависимым процессом, а сама герметизация аксона необходима для сохранения жизнеспособности нервных терминалей.

Второй важный момент заключается в том, что между перерезанием нервов и нанесением красителя на срез нерва должно пройти не более пяти минут. По истечении пяти минут концы аксонов перестанут пропускать конъюгаты декстрина с индикаторами кальция с молекулярной массой 10 000. Соблюдение этого временного лимита потребует определенной практики.

Не пытайтесь замедлить рост аксонов путем снижения уровня кальция, так как это может нарушить будущую физиологическую функцию поврежденного нерва. После 40-минутной инкубации препарата в среде Шнайдера прикоснитесь кончиком наполняющей нити к поверхности ванны и снова вставьте ее, чтобы удалить большую часть раствора индикатора кальция из кончика и стартера. Затем, используя нить, наберите свежую среду Шнайдера из ванны и полностью заполните ею ложе.

В слое не должно быть пузырьков, так как раствор Шнайдера будет служить одним из проводников, изолированных от ванны. Пока стимулируется стеклянный электрод нерва, снова поместите препарат в темное место минимум на 60 минут, но не более чем на четыре часа, промывая его свежим раствором Шнайдера каждые 30 минут в течение инкубации. Индикатор кальция транспортируется вниз. Аксон концентрируется в терминали нерва за 20 минут до планируемого исследования препарата. Промойте его раствором HL6.

Обеспечьте желаемый уровень кальция; если уровень кальция превышает примерно 0.4 millimolar, добавьте глутамат или L-глутаминовую кислоту в HL6 в концентрации 7 millimolar, чтобы остановить вызванное нервом сокращение мышц. Раствор Шнайдера не подходит для визуализации кальция, так как он уже содержит высокие уровни как глутамата, так и кальция. Эти уровни вам потребуется скорректировать.

Тейт также присутствует, что позволяет проводить как автофлуоресцентную загрузку по Шнайдеру, так и визуализацию в HL 6, при условии, что концентрация кальция во время загрузки составляет не менее 2 млн. При размещении препарата на сложном микроскопе для визуализации снова убедитесь, что вы сняли все статическое электричество. Затем с помощью пинцета коснитесь и раствора в ванночке, и объектива.

Если используется иммерсионный объектив, опустите его до ванночки, затем кратковременно заземлите основание стимулирующим образом, либо поместите один электрод в ванночку, а другой введите вниз; при подаче прямоугольных импульсов постоянного тока напряжением менее 3 V и длительностью 300 µs будет надежно вызываться потенциал действия в нерве. Здесь мы видим два набора нервных окончаний в щели между мышцами шесть и семь, которые стали видимыми благодаря стимуляции цитозольной экспрессии GFP. Они также были заполнены путем переднего заполнения индикатором кальция Rod Dextrin, который имеет отличные от GFP спектры возбуждения и испускания.

В этом поле зрения все еще видны нервные терминали, но краситель Rod Rin обладает низким сродством к кальцию и почти невидим, пока нерв находится в состоянии покоя. Однако он обладает высокой чувствительностью к кальцию, который поступает в терминали во время одиночных потенциалов действия или коротких двухсекундных серий стимулов. Как показано здесь, при флуоресцентном анализе только что продемонстрированных плотных серий частотой 80 hertz, ответы в терминалях типа 1 S обычно превышают ответы в терминалях типа 1 B.

Кальциевые индикаторы с низким сродством, такие как Rod-декстрин и Flu-4. Rod-декстрин демонстрирует почти линейный отклик на частоту стимуляции нерва в этих терминалях в диапазоне от 10 до 80 hertz. Приведенный здесь пример получен из нервного окончания на мышце номер четыре, нагруженной Rod-декстрином.