Опорно-двигательного опробование, обучение и память Дефицит Drosophila Модели нейродегенерации

Общая цель данной процедуры заключается в изучении обучения и памяти у взрослых особей *Drosophila melanogaster*; прежде всего необходимо определить, имеют ли мухи нарушения локомоторной функции. Их тестируют с помощью анализа отрицательного геотаксиса. Затем проверяют положительное фототаксическое поведение, помещая мух в Т-образный лабиринт и фиксируя латентный период перемещения в предпочтительную освещенную камеру.

Затем мух с положительным фототаксисом приучают ассоциировать освещенную камеру с горьким вкусом хинина. В конечном итоге проверяется, насколько эффективно мухи ассоциируют аверсивный стимул с освещенной камерой, что позволяет оценить процессы обучения и памяти. Ола, добро пожаловать в лабораторию X.

Сегодня мы продемонстрируем вам два широко используемых поведенческих теста для изучения нейродегенерации у drosophila. Сначала мы покажем тест на подавление аверсивного фототаксиса, который проведут Уилл Фредо Сала, студент нашего лабораторного курса, и я, после чего последует тест на негативный геотаксис, продемонстрированный Кайваном, аспирантом нашей лаборатории. Содержите мух на стандартной кукурузно-агаровой среде с патокой и дрожжами при 25 °C с 12-часовым циклом свет/темнота.

В день окклюзии распределите неспаренных мух по группам по 20 особей. Неспаренных мух определяют по светлому окрасу и темно-зеленому пятну на нижней стороне брюшка. Мух следует пересаживать в новый флакон каждые три дня; для минимизации различий, обусловленных генетическим фоном, следует использовать особей одного помета.

В исследовании геотаксиса следует протестировать от 10 до 20 групп для каждого генотипа или варианта обработки. Для начала распределите мух женского и мужского пола по группам по 10 особей. Эти группы мух должны тестироваться раздельно.

Поскольку пол существенно влияет на поведение, после введения анестезии следует подождать не менее одного часа, прежде чем приступать к дальнейшим действиям, чтобы убедиться, что локомоторная активность не нарушена. После полной подготовки мух совместите отверстия двух пустых полистирольных пробирок, соединив их вертикально, установив одну на другую.

Отмерьте восемь сантиметров от дна и обведите окружность по периметру. После сборки установки перенесите группу из 10 мух в нижний флакон. Сразу же соедините флаконы и дайте мухам адаптироваться в течение одной минуты перед началом тестирования.

После того как мухи успокоятся, осторожно постучите по флакону, чтобы они спустились на дно, и через 10 секунд подсчитайте количество мух, поднявшихся выше отметки восемь сантиметров. Количество мух в группе, преодолевших эту отметку, записывается в процентах от общего числа мух. Повторите эту процедуру 10 раз для каждой группы, давая мухам отдохнуть в течение одной минуты между попытками.

За шесть часов до проведения анализа PS отсортируйте самок мух в полистирольные флаконы, содержащие увлажненную водой фильтровальную бумагу. Этот этап необходим для того, чтобы мухи были голодными и более чувствительными к аверсивному вкусу. В данном анализе в качестве аверсивного стимула используется раствор хинина.

Приготовьте рабочий раствор с концентрацией 1 µM из стокового раствора 0,1 M. T-образный лабиринт состоит из центрального коридора с откидной дверцей и двух боковых камер: темной и освещенной. На отметке 2 мм с помощью ручной пилы отрежьте закрытый конец двух пластиковых центрифужных пробирок объемом 15 мл, установите соединительные адаптеры на каждом конце и герметизируйте соединение параформом.

Оберните одну пробирку алюминиевой фольгой, чтобы создать темную камеру. Соберите ТМА, прикрутив освещенную и темную камеры по обе стороны центральной колонки. При закрытой центральной заслонке завершите сборку установки, подключив источник света к адаптеру освещенной камеры. Перед проведением анализа перенесите каждую муху из группы по 10 особей в пустую центрифужную пробирку объемом 15 milliliter и слегка закройте крышку, чтобы предотвратить побег.

Затем открутите темную камеру от TMAs. Перенесите одну муху в пробирку и немедленно вставьте ее обратно в лабиринт. Выключите свет в помещении и включите красную лампу.

Дайте мухе акклиматизироваться в темной камере в течение 30 секунд, после чего медленно включите источник света, освещающий светлую камеру. После включения света откройте заслонку, разделяющую две камеры. Если муха переходит в светлую камеру в течение 10 секунд, она считается положительно фототаксичной и готова к обучению.

Отсутствие такой реакции указывает на проблему в зрительной системе и требует исключения особи из анализа. После подтверждения положительного фототаксиса переправьте муху обратно в темную камеру, закройте заслонку и выключите свет на 32-секундный период отдыха. Подготовьте аверсивный стимул, поместив фильтровальную бумагу в освещенную камеру и пипеткой нанеся 1 мл раствора хинина на бумагу.

Убедитесь, что вся фильтровальная бумага полностью увлажнена аверсивными стимулами. Чтобы начать кондиционирование, медленно откройте дверцу ловушки и включите свет. Позвольте мухе зайти в освещенную камеру с запахом хинина.

Через одну минуту коснитесь мухи, чтобы она вернулась в темную камеру. Повторите эту процедуру девять раз, чтобы в общей сложности провести 10 проб кондиционирования. Как правило, после трех-пяти тренировочных проб мухи данного типа начинают избегать освещенной камеры сразу после завершения обучения.

Проведите пять тестовых испытаний. Если обученная муха не заходит в освещенную часть камеры в течение 10 секунд, это регистрируется как успешный результат. Записывается и определяется доля успешных попыток за пять последовательных испытаний.

PC ноль. После обучения и первичных записей PC ноль каждую муху помещают обратно в соответствующий пронумерованный контейнер с кормом и оставляют на шесть часов. Через шесть часов после обучения проводят пять дополнительных тестовых испытаний, как было продемонстрировано ранее; этот процент успешных попыток представляет собой PC шесть и служит показателем краткосрочной памяти.

В анализе отрицательного геотаксиса количество мух, пересекающих отметку в восемь сантиметров, переводится в проценты и представляется как показатель проходимости при подъеме. В ходе 10 испытаний, показанных здесь справа, 10-дневные самцы или самки мух с гиперэкспрессией человеческого тау-белка демонстрируют значительные нарушения локомоции по сравнению с одновозрастными мухами с гиперэкспрессией GFP, показанными слева.

Результаты теста на подавление аверсивного фототаксиса представлены в виде среднего процента прохождения или доли успешных попыток избегания. В общем количестве испытаний мухи с гиперэкспрессией tau, показанные справа, в меньшей степени ассоциируют свет с горьким вкусом по сравнению с контрольной группой слева, как непосредственно после обучения, так и при тестировании через шесть часов. После завершения этой процедуры можно отобрать образцы для иммуногистохимического анализа, чтобы ответить на дополнительные вопросы о морфологических различиях. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как изучать обучение и память у мух.

И помните, что все зависит от вас.