Подготовка и культуры Куриные ломтики Слуховые мозга

Общая цель этой процедуры заключается в подготовке куриных, слуховых срезов ствола мозга для использования в пробирке для физиологии цельных клеток in vitro или долгосрочных органотипических культур. Это достигается путем предварительного извлечения эмбриона из яйцеклетки. Вторым этапом процедуры является отделение мозга от черепа и выделение слуховой области ствола мозга.

Третьим этапом процедуры является подготовка срезов области ствола мозга на виоме. Заключительным этапом процедуры является помещение срезов ствола мозга в камеру для записи физиологии или на пластины Millipore для культивирования. В конечном счете, могут быть получены результаты, которые показывают здоровые слуховые срезы ствола мозга из куриных эмбрионов с помощью физиологических записей или долгосрочных органотипических культур.

Здравствуйте, меня зовут Арманд Сидл. Оба эти метода могут дать представление о слуховом развитии птиц. Он также может быть использован для изучения топографической регенерации экзонов, динамики дендритов, а также внутренних и синаптических свойств благодаря уникальной структуре и функции этой бинауральной слуховой цепи.

Как правило, люди, плохо знакомые с этой техникой, будут испытывать трудности. Ткань необходимо быстро препарировать, нарезать и хранить, чтобы получить жизнеспособные образцы для физиологических и культивирующих подходов. Сначала приготовьте 4%-ный раствор агара, добавив 40 миллиграммов агара на миллилитр дистиллированной воды, и нагрейте в микроволновке до закипания.

Налейте горячий раствор агара в чашку Петри и дайте ему остыть до твердости после застывания. Вырежьте небольшой кусок агара и приклейте его к сцене вибрато. Затем приготовьте от 500 до 1000 миллилитров искусственной спинномозговой жидкости или спинномозговой жидкости на потом.

Используйте в камере вибрато путем непрерывного барботирования смесью 95% кислорода, 5% углекислого газа в диапазоне pH от 7,2 до 7,4 и осмолярностью от 295 до 310 миллиосмолей на литр. Пока спинномозговая жидкость пузырится, очистите рассекаемые участки для культивирования, вибром и лезвием с 70% этанолом. Промойте лезвие вибрама дистиллированной водой и дайте ему высохнуть, положите чистую абсорбционную подушечку на область препарирования и разложите соответствующие инструменты для препарирования, обычно состоящие из скальпеля, ножниц, пинцета, бритвенных лезвий, булавок, чашки Петри и шпателя под стерильным капюшоном для культуры тканей

Хорошо насыпьте в тарелку один миллилитр культуры, средьте и инкубируйте при температуре 35 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. Подготовьте столько вставок для культуральной мембраны, сколько необходимо, и храните их в колпаке на потом. Используйте на диске для препарирования.

Поместите яйцо под источник света, чтобы найти заполненное воздухом пространство, пустое от эмбриона, которое обычно является большой стороной яйца. Разломайте большую сторону яйца с помощью плоского конца лопатки, обнажив мембранный мешок. Сделайте надрез в мембранном мешочке с помощью скальпеля или ножниц, а затем аккуратно извлеките головку куриного эмбриона с помощью лопатки.

С помощью ножниц. Быстро обезглавливают голову зародыша. Поместите кончик лезвия бритвы немного позади середины глаз и сделайте ростраль, чтобы ухаживать за разрезом по средней линии черепа.

Мягкое давление для более молодых эмбрионов. Используйте меньшее давление для более старых эмбрионов. Используйте больше после того, как был сделан разрез.

Аккуратно отодвиньте кожу и перья, чтобы пожилые животные обнажили череп и подтвердили среднюю линию. Резать. Используя сильное давление, заблокируйте ростральную часть черепа, разрезав лезвием бритвы. Расположите лезвие сзади от глаз и быстро разрежьте весь череп и мозговую ткань.

Положите заблокированную салфетку на чашку Петри стороной княжей вверх. Прокалывайте ткани через латеральную область мышц и полностью погружайте в воду пузырьки. Спинномозговая жидкость.

Сделайте разрезы от средней до боковой с помощью небольших ножниц в каудальной области черепа, немного впереди видимых мышц шеи с обеих сторон головы. Оттяните череп и ткани, чтобы обнажить мозжечок и мозг. Теперь, когда ткань мозга обнажена, найдите мозжечок и ствол мозга, чтобы удалить ткань из черепа.

С помощью маленьких ножниц аккуратно отрежьте от основания черепа прикрепленную ткань, которая окружает ствол мозга с вентральной стороны. После того, как ствол мозга будет удален из черепа, прикрепите его к чашке Петри, наполненной сигарой, через оптику. Далее полностью удалите мозжечок, разрезав ножницы маленькими ножницами, обнажив дно четвертого желудочка.

С помощью пинцета удалите любую оболочку ткани и кровеносные сосуды с поверхности ствола мозга и сделайте боковые надрезы через зрительный мешок. Чтобы освободить ствол мозга, аккуратно и быстро нанесите небольшое количество суперклея на столик Vibram перед агаровым блоком с помощью наклонного пинцета. Поднимите ствол головного мозга в области спинного мозга и поместите ткань на суперклей ростральной стороной вниз и тыльной стороной по направлению к лезвию вибрама.

Возьмите излишки клея с помощью бумажной салфетки или фильтровальной бумаги. Аккуратно заполните вибрационную ступень примерно 100 миллилитрами насыщенного кислородом ликвора. Если нарезка выполняется быстро, можно использовать приготовленный кислородосодержащий ликвор А.

Из первого раздела. Расположите лезвие вибрама так, чтобы оно находилось под углом от 20 до 22 градусов по отношению к столику вибрама. Запускайте вибрам с максимальной амплитудой колебаний.

Затем переместите столик вверх по лезвию так, чтобы верхняя часть ткани была параллельна лезвию. Перед нарезкой. Быстро переместите лезвие к тканям ствола мозга, но значительно замедлите движение непосредственно перед тем, как лезвие соприкоснется с тканью.

Теперь, когда лезвие находится на месте, начните резать ткань как можно более медленным движением вперед. Пройдя по всему корональному срезу ткани, аккуратно отодвиньте срезы от лезвия с помощью кисти и выбросьте. Опустите ступень вибрато с шагом от 300 до 500 микрометров и нарежьте.

Снова повторяйте до тех пор, пока в тканях ствола мозга не станут видны анатомические сигнатуры, отбросив все предыдущие срезы. Теперь разрежьте и соберите ткань ствола мозга, содержащую слуховые структуры в количестве от 200 до 1000. Микрометровые толщины тщательно собираем пригодные к использованию ломтики в порядке нарезки.

Если срезы будут использоваться для физиологии in vitro, которая будет показана в следующем разделе этого видео, они должны храниться в специальных камерах, изготовленных из полых пластиковых трубок, открытых сверху, и нейлоновой сетки, приклеенной снизу. Каждая отдельная камера прикреплена к более крупной камере хранения, в которой непрерывно пузырится около 350 миллилитров ликвора. Если срезы должны использоваться для органических типичных культур, см. следующий раздел сразу после сбора срезов для переноса срезов приблизительно 500 миллилитров A CSF с использованием дозатора из полированного огнем, прикрепленного на одном конце резиновой колбой к 48-луночной пластине со льдом.

Размещение одного среза в лунку и соблюдение порядка нарезки. Когда закончите, собрав все срезы одного мозга, поднесите планшет с 48 лунками к культуре тканей. Достаньте из инкубатора подготовленную ранее пластину с шестью лунками и поднесите ее к колпаку.

Поместите мембранную вставку в лунку с питательной средой, убедившись, что под ней не застряли пузырьки воздуха. С помощью стеклянной пипетки перенесите один срез в капле ликвора на влажную мембрану. Вставьте и удалите излишки спинномозговой жидкости, которые все еще находятся сверху, с помощью микропипетки.

Повторите то же самое не более для четырех ломтиков на мембрану и расположите ломтики так, чтобы они не касались друг друга или края мембраны. Храните культуры в инкубаторе при температуре 35 градусов Цельсия и поддерживайте их, меняя питательную среду три раза в неделю под вытяжкой для культуры тканей. Поместите каждый ломтик в отдельную камеру хранения с помощью пипетки из полированного огнестрельного стекла, на одном конце которой находится резиновая груша.

Продолжая поддерживать порядок нарезки. Камера выдержки должна быть заполнена ранее приготовленным ликвором А и постоянно пузыриться смесью 95% кислорода и 5% углекислого газа в течение всего времени проведения физиологических экспериментов. Дайте ломтикам сбалансироваться, поместив камеру выдержки в водяную баню с температурой 35 градусов Цельсия примерно на один час, а затем дайте ей отдохнуть при комнатной температуре в течение 30 минут.

Ломтики можно использовать в течение шести часов после извлечения из теплой ванны. Через 30 минут при комнатной температуре срезы можно переносить из камеры выдержки в записывающую камеру объемом 0,5 миллилитра, установленную на микроскопе для электрофизиологических экспериментов. Здесь показана репрезентативная схема и изображения in vitro срезов слуховой цепи курицы.

Изображения среза типичны для слуховой области ствола мозга и с практикой могут быть легко идентифицированы. ЛОР-входы возбуждающие входы от слухового нерва или N проецируются как на ядро Magno cellis или NM, так и на ядро angularis или N na. NM проецирует двусторонние возбуждающие входы в ядро, ламины или NL с обеих сторон ствола мозга.

Ингибирующий вход от верхнего оливарного ядра или SON проецируется на na, nm и nl. Здесь через семь дней показан корональный срез слухового ствола мозга курицы Е 11. В культуре.

Нейроны были помечены с помощью иммуногистохимических методов, антителом против белка, связанного с микротрубочками, который встречается в соме и дендритах, помечает нейроны зеленым цветом. Кластер нейронов и аксонов NM помечается красным цветом с помощью электропорации красителя рин. Можно увидеть, как ипсилатеральные nm терминали аксонов, обозначенные белыми стрелками, проецируются на дорсальные дендриты NL.

Здесь показаны наложенные изменения напряжения мембраны в ответ на гиперполяризующие и деполяризующие токи от острой и культивируемой ткани через четыре и семь дней в культуре. Обратите внимание на изменения в гиперполяризующем просадке напряжения, сильном снижении внешнего тока и возбуждении потенциала одиночного действия, которые развиваются аналогичным образом при подходе с культурой срезов. По сравнению с возрастными эквивалентами острых тканей мембранные потенциалы покоя составляли от минус 55 до минус 60 мВ. После освоения эта техника может быть выполнена менее чем за 15 минут, если все сделано правильно.

Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить об использовании соответствующих стерильных методов, и после просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как готовить ломтики куриного слухового стебля для использования для физиологических записей или для культивирования.