Подкожный Заражение метициллину Staphylococcus Aureus устойчивы (MRSA)

Общая цель следующего эксперимента заключается в изучении выживаемости и распространения метициллин-резистентного золотистого стафилококка (MRSA), а также уровней хемокинов и цитокинов в очагах инфекции. Для этого шерсть на спинах мышей удаляют, чтобы обеспечить чистую область наблюдения. Вторым этапом.

Суспензию MRSA вводят мышам подкожно через три дня после заражения; патологии инфекции и количество бактерий можно оценить, определив число колониеобразующих единиц в гомогенатах тканей на агарных пластинках. Здравствуйте, как ваши дела? Меня зовут Де Лордон.

Я исследователь-постдок. Здравствуйте, меня зовут Мариэль Санчес. Я аспирантка, а я — Андреа Худа.

Я — научный сотрудник лаборатории Джорджа Ли на кафедре педиатрии Медицинского центра Седар-Синай. Данный метод может помочь в решении ключевых вопросов медицины, таких как моделирование тяжелых инфекций, включая миозит, полимиозит и некротизирующий фасциит. Несмотря на то, что этот метод позволяет изучать острые экстренные инфекции, он также может быть применен к другим системам, таким как стрептококк группы A и другие организмы.

Кроме того, мы можем изучить функции и патогенез других организмов, вызывающих миозит и полимиозит. Как правило, специалисты, впервые выполняющие данную процедуру, могут столкнуться с трудностями, поскольку один из глобальных регуляторов областей каукуса обладает высокой мутабельностью. Если не принять меры предосторожности, собранные данные могут иметь значительную вариативность, что приведет к затруднениям при их интерпретации.

Приступим к работе. В лаборатории уровня биобезопасности BSL-2 подготовьте чашку с кровяным агаром овцы на основе TSA и стерильную петлю, используя замороженный блок. Извлеките сток-культуру Mercer из хранилища при температуре -80 °C.

Затем с помощью стерильной петли перенесите небольшой кусочек льда из стоковой культуры на чашку. Сразу после этого верните стоковую культуру Mercer обратно в морозильник, чтобы избежать оттаивания, так как повторные циклы замораживания и оттаивания могут повредить культуру. Используйте петлю для посева на агар методом штриха для обеспечения роста отдельных колоний Mercer.

Инкубируйте планшет при 37 °C в течение ночи без добавления CO2. На следующий день подготовьте и промаркируйте новый чашку с кровяным агаром, чашку с TSA и пробирку с защелкивающейся крышкой объемом 15 мл, содержащую 3 мл THB.

Возьмите чашку с M SSA, в которой культуру инкубировали в течение ночи, и изучите гемолитический фенотип колоний. С помощью стерильной петли выберите колонию, фенотип которой соответствует фенотипу колоний в предыдущих экспериментах. Инокулируйте THB выбранной колонией, используя тот же метод посева петлей.

Инкубируйте чашку с раствором THB при 37 °C в течение ночи при перемешивании со скоростью 220 об/мин. Эти бактерии будут использованы для инокуляции культуры при подкожном заражении мышей на последующих этапах. Также поместите чашку с кровяным агаром в инкубатор.

Планшет будет использован следующим утром для подтверждения того, что гемолитический фенотип бактерий в растворе THB совпадает с фенотипом первоначально выбранной колонии. Если фенотип гемолиза не соответствует исходному клону, не приступайте к эксперименту. Переместите мышь на платформу и выбрейте шерсть на спине.

Если животное проявляет чрезмерную агрессию, может потребоваться седация изофлураном. Нанесите примерно пять кубических миллиметров крема для удаления волос, такого как NA, на выбритую область. Препарат NA можно приобрести в местной аптеке.

Обязательно приобретите крем для удаления волос, содержащий детское масло, так как продукт без него окажет слишком сильное раздражающее действие на мышей. Оставьте крем на поверхности кожи примерно на одну минуту; пока крем действует, смочите несколько бумажных полотенец дважды дистиллированной водой. По истечении минуты с помощью влажных бумажных полотенец тщательно протрите выбритую область.

Убедитесь, что на коже не осталось крема для удаления волос. Предварительно прогрейте 10 milliliters THB в пробирке с завинчивающейся крышкой объемом 50 milliliters при 37 degrees Celsius в бактериальном инкубаторе в течение от 4 до 10 часов. Перенесите 20 microliters ночной бактериальной культуры в прогретый THB. Это позволит развести ночную культуру merc.

Приготовьте суспензию в разведении от 1:100 до 1:500. Поместите пробирку в шейкер-инкубатор при температуре 37 °C и скорости 220 об/мин примерно на два с половиной — три часа. После периода инкубации используйте дополнительный бульон THB для дальнейшего разведения бактериальной суспензии до 1:10 и измерьте плотность суспензии с помощью спектрофотометра.

При абсорбции на 514 нанометрах. Продолжайте инкубировать суспензию при 37 °C с перемешиванием при 220 об/мин, пока значение суспензии в разведении 1:10 не достигнет 0,25. Чтобы собрать M er, центрифугируйте пробирку объемом 50 мл при 3 225 ×g в течение 10 минут при 4 °C, удалите супернатант и ресуспендируйте.

Суспендируйте бактериальный осадок в 10 миллилитрах DPBS и повторно промойте бактерии, повторив этап центрифугирования для данной модели тяжелой инфекции. Повторно суспендируйте бактериальный осадок примерно в одном миллилитре DPBS, чтобы получить концентрацию примерно 1 × 10¹⁰ колониеобразующих единиц на миллилитр. Подготовьте чашки с кровью овцы A-R-T-S-A, проведите серийное разведение бактерий от 10⁻¹ до 10⁻⁸ в DPBS и высейте на чашки.

Нанесите по 10 µL капель серийно разведенной бактериальной суспензии на чашку с кровяным агаром в трех повторностях. Инкубируйте чашки при 37 °C в течение ночи. После инкубации в течение 16–18 часов определите и зафиксируйте фенотип гемолиза инокулята.

Подсчитайте количество колониеобразующих единиц на чашках. Инфицирующая доза будет рассчитана на основании количества колониеобразующих единиц на чашках.

Подготовьте шприц со 100 µL бактериальной суспензии в DPBS, приготовленной ранее. Перед инъекцией мышей следует подвергнуть седации так, чтобы частота их дыхания составляла примерно один вдох в секунду. В целях демонстрации в данном видео показана эвтаназированная мышь.

После инъекции введите M ser в один из боков. Переместите мышь обратно в клетку. Наблюдайте за животными в течение трех-пяти часов после инъекции, чтобы убедиться, что мышь жива, прежде чем возвращать её в виварий.

Ежедневно наблюдайте за поражениями на спинах животных после их забия. Измерьте и зафиксируйте размер и состояние поражений кожи. Площадь поражений кожи и мышц количественно определяется путем перемножения длины и ширины поражения в миллиметрах.

Повреждения неправильной формы необходимо разделить на более мелкие симметричные фрагменты, размер каждого из которых измеряется одним и тем же методом. Подготовьте микроцентрифужные пробирки объемом 1.5 ml, containing 100 µL DPBS для сбора тканей. Сделайте надрез на коже стерильным лезвием и иссеките поврежденный участок стерильными ножницами.

При иссечении очага поражения убедитесь, что также удалено примерно два-пять миллиметров здоровой кожи вокруг данной области. Поместите пораженный участок в пробирки для сбора тканей для последующего анализа мышечных поражений. Осторожно отделите кожу, чтобы измерить размер и зафиксировать состояние очага поражения в мышечной ткани.

Извлеките селезенку и почки. Поместите эти ткани в отдельные пробирки для сбора. Гомогенизируйте ткани, перемешивая их с помощью одномиллилитрового шприца в течение примерно 30 секунд.

Добавьте по 900 µL DPBS в каждую пробирку. Подготовьте планшеты для ТГА и перемешайте гомогенизированные образцы тканей на вортексе в течение пяти минут. Выполните серийное разведение образца.

Приготовьте суспензии с разведениями от 1 до 10⁶. В 96-луночные планшеты внесите по 10 µL каждой серийно разведенной суспензии. Инкубируйте планшеты в бактериологическом инкубаторе при 37 °C в течение ночи.

На следующее утро подсчитайте количество колониеобразующих единиц на чашках и рассчитайте общее число колониеобразующих единиц с учетом коэффициентов разведения. При правильном проведении инфицирования сразу после подкожной инъекции на поверхности кожи должна образоваться папула. Если папула не наблюдается, инъекция могла быть слишком глубокой, что может повлиять на результат инфицирования.

Размер поражения и выживаемость бактерий можно оценивать в различные моменты времени после инфицирования MSA. Следующие поражения кожи были исследованы на третий день после инфицирования; они представляют собой примеры поражений у мыши линии CD-1, инфицированной на одном фланке дозой 1 × 10⁷ колониеобразующих единиц. Поражения мышц обычно обнаруживаются в тканях под поражениями кожи.

Ниже представлены примеры соответствующих поражений поверхности мышц для ранее показанных фотографий поражений кожи. Это поражения мышц, наблюдаемые на третий день после инфицирования мыши дозой 1 × 10⁷ колониеобразующих единиц. Площадь поражения определяется как произведение длины на ширину поражения в миллиметрах и может использоваться для оценки повреждения тканей кожи.

Количество колониеобразующих единиц бактерий, локализованных в месте инфекции, можно количественно определить в иссеченных очагах поражения. Подсчет колониеобразующих единиц позволяет определить, обеспечивает ли фактор вирулентности преимущество в выживаемости MSA. При выполнении данной процедуры важно соблюдать стандартные меры предосторожности в связи с использованием игл и высокопатогенных микробов.

В качестве последней модели абсцесса мы используем дозу инокулята, которая в 1 000 раз меньше, чем в нашей основной модели; это позволяет ответить на дополнительные вопросы, например: какие факторы S способствуют персистирующей инфекции RSA? Не забывайте, что работа со шприцами, заполненными Mars A, может быть крайне опасной, поэтому необходимо соблюдать меры предосторожности, такие как утилизация шприца непосредственно в контейнер для острых предметов, чтобы избежать случайного укола иглой. Кроме того, в данном эксперименте важно соблюдать стандартные протоколы БСЛ-2 (BSL-2) для обеспечения надлежащей дезинфекции рабочей зоны.

На этом все. Спасибо за просмотр. Привет. Привет, пока.