ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Преобразование плазмидной ДНК в e.coli, с использованием метода теплового шока

Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method

Преобразование плазмиды ДНК в E.coli, методом теплового шока основную технику молекулярной биологии. Она состоит из вставки иностранных плазмиды или перевязки продукта на бактерии. Это видео протокол описывает традиционный метод преобразования с использованием коммерчески доступных химически компетентных бактерий из Genlantis. После короткой инкубации в лед, смеси химически компетентных бактерии и ДНК находится на 42 ° С в течение 45 секунд (тепловой шок), а затем помещен обратно в лед. SOC СМИ добавляется и трансформированные клетки инкубируют при 37 ° С в течение 30 мин при перемешивании. Чтобы быть уверенным в изоляции колоний, независимо от эффективности трансформации, две величины трансформированных бактерий покрытием. Этот традиционный протокол может быть успешно использован для преобразования самых коммерчески доступных компетентных бактерий. Turbocells от Genlantis также может быть использован в романе 3-х минутах преобразование протоколов, описанных в инструкции по эксплуатации.

Преобразование плазмидной ДНК в E.coli, с использованием метода теплового шока

Трансформация плазмидной ДНК в E. coli с помощью метода теплового шока является базовым методом молекулярной биологии. Она заключается во введении чужеродного ...

Здравствуйте, я Алекс Хог. Я работаю в лаборатории Гим Холл на кафедре физиологии и биофизики Калифорнийского университета в Ирвайне. Сегодня я покажу вам, как проводить трансформацию электрокомпетентных клеток e coli методом электропорации.Сегодня я использую данный метод для трансформации клеток E. coli моим продуктом лигирования, так как я планирую провести гибридизацию in situ на всём препарате у zebrafish. Итак, приступаем к трансформации. Сначала необходимо подготовить водяную или сухую баню, установив температуру 42 °C.Бактерии, которые вы только что извлекли из основного стока, должны находиться на льду. Сегодня мы будем использовать электрокомпетентные клетки из итиев, а также вашу ДНК на льду. Кроме того, вам понадобится пробирка со средой SOC при комнатной температуре или 37 °C и чашки с питательной средой LB с добавлением антибиотика.Теперь я добавлю ДНК к бактериям. Я работаю рядом с пламенем горелки, чтобы избежать контаминации бактерий. Таким образом, я вношу раствор с бактериями.Добавьте 50 µL бактерий и немедленно верните пробирки на лед; можно слегка встряхнуть их, чтобы перемешать бактерии с вашей ДНК, и оставить на льду до 15 минут. Теперь, когда прошло 15 минут, мы готовы приступить к тепловому шоку, который заключается в выдерживании бактерий при 42 °C в течение 45 секунд. Я достаю пробирки изо льда и помещаю их непосредственно в термостат с температурой 42 °C, засекаю 45 секунд на таймере, после чего очень быстро возвращаю их на лед, перенося из среды с температурой 42 °C сразу на лед.Затем мы выжидаем две минуты. Теперь я добавлю среду SOC к бактериям и выдержу их при 37 °C в течение 30 минут. Я добавляю 500 µL среды SOC к бактериям и помещаю их в свою небольшую самодельную камеру.Таким образом, если вы планируете использовать пробирки типа «eend» и импровизированную камеру в качестве инкубатора, обязательно расположите пробирки горизонтально, так как при таком положении перемешивание будет происходить гораздо эффективнее. Теперь мы готовы поместить пробирки в шейкер. Именно для этого мы используем данную небольшую камеру при 37 °C в течение 30 минут.Итак, инкубация при 37 °C завершена, и теперь мы приступим к высеву бактерий на среду LB с антибиотиками. В моем случае это хлорамфеникол. Я переношу по 50 µL каждого образца на чашку с агаром.Оставшиеся 500 µL центрифугируют в настольной центрифуге, чтобы осадить бактерии. После центрифугирования мы получаем четкий осадок; теперь необходимо удалить почти всю среду SOC, оставив лишь 50 µL, после чего эти 50 µL концентрированной суспензии бактерий можно будет высеять на чашки. Таким образом, я удалил примерно 450 µL среды.Я оставляю именно такой объем. Теперь я суспендирую осадок в оставшихся 50 µL среды SOC. После этого я смогу высеять данные 50 µL на другую чашку.Затем я встряхиваю каждую пробирку, делаю посев и переношу культуру на чашки. Таким образом, в итоге получится по две чашки на образец. Теперь нам необходимо распределить бактерии по поверхности чашки с LB-агаром.Я буду использовать стерилизованные в автоклаве стеклянные шарики, но вы также можете использовать пластиковую трубку, придав ей форму шпателя. Таким образом, я помещу несколько шариков в чашку Петри. Мне такой способ нравится.Итак, 10 15. После добавления микросфер положите все планшеты стопкой таким образом и аккуратно встряхните их, чтобы микросферы равномерно распределили бактерии по всей поверхности планшетов. Затем перемещайте планшеты до их полного высыхания.Таким образом, при перемещении гранул не должно быть видно больших полос жидкости. Например, на этой планшете гранулы склонны слипаться, и видно много полос. А вот здесь гранулы перемещаются свободно — значит, эта поверхность сухая.Теперь, когда планшеты высохли, мы можем удалить магнитные частицы. Я просто вытягиваю их таким образом, чтобы их можно было утилизировать. Теперь мы помещаем планшет в инкубатор при 37 °C на ночь, при этом планшеты следует перевернуть. После 12 часов инкубации при 37 °C мы извлекаем планшет из инкубатора.Как мы видим, на чашке, куда я высеял 50 µL, образовалось меньше колоний, чем на чашке, где был высеян остальной объем. При трансформации бактерий важно добиться правильного количества колоний на чашке, то есть подходящей плотности. В данном случае колоний очень мало, однако для получения большего количества можно использовать этот пример: на данной чашке плотность оптимальна и составляет примерно 100 колоний на чашку.Эта пластина является неудачным примером, так как на ней слишком много колоний и невозможно выделить отдельные из них. Таким образом, я продемонстрировал вам способ трансформации e coli с помощью каждого метода трансформации. Очень важным аспектом данной методики является поддержание всех компонентов в охлажденном состоянии на льду до момента теплового шока.Затем 45 секунд в обычном режиме, далее 42 °C, затем снова на лед. Все остальные этапы должны проходить при повышенной температуре или 37 °C. Теперь я приступлю к скринингу колоний с помощью ПЦР.Таким образом, одна из целей также состоит в том, чтобы иметь две чашки. Ожидается, что на одной из них будет много колоний, а на другой — меньше. Важно, чтобы ваши чашки были очень сухими, что достигается с помощью использования бусин или пипеток.Спасибо за просмотр и удачи в проведении подтверждения.

transformation-of-plasmid-dna-into-e-coli-using-the-heat-shock-method

Research

JoVE Journal

Biology

Биология

Сайт направленного мутагенеза целых плазмид простой способ создать несколько различных вариантов оригинальных плазмиды. Здесь мы показываем, простой и экономически эффективный способ представить база замен в плазмиду с использованием реагентов стандарта.

Домашний сайт направленного мутагенеза Всего Плазмиды

Источник: Стефан, А., и др., Многогранные преимущества коэкспрессии белка в кишечной палочке. J. Vis. Exp. (2015)В этом видео показана процедура трансформации Escherichia coli в плазмиду, несущую ген устойчивости к антибиотикам, включая подготовку клеток, электропорацию, восстановление и выбор трансформантов.

Подготовка и трансформация бактерий с помощью высоковольтной электропорации

Этот протокол демонстрирует шаперонную активность белка теплового шока 70 (Hsp70). Клетки E. coli dnaK756 служат моделью для анализа, поскольку они содержат нативный, функционально ослабленный Hsp70, что делает их восприимчивыми к тепловому стрессу. Гетерологичное введение функционального Hsp70 спасает дефицит роста клеток.

Анализ комплементации на основе Escherichia coli для изучения шаперонной функции белка теплового шока 70

Сборка in vivo — это независимый от лигирования метод клонирования, который основан на собственных ферментах репарации ДНК у бактерий для сборки фрагментов ДНК путем гомологичной рекомбинации. Этот протокол является как быстрым, так и экономически эффективным, так как требуется небольшое количество реагентов, а эффективность клонирования может достигать 99 %.

Использование сборки in vivo для высокоэффективного конструирования плазмид

В данной статье описана методика сверхэкспрессии рекомбинантного Nsp15, токсичной нуклеазы, в системе экспрессии C41(DE3) с последующей очисткой меченого белка с помощью аффинной и эксклюзионной хроматографии. Эти протоколы могут быть адаптированы для других сложных токсичных белков.

Сверхэкспрессия и очистка токсичной нуклеазы из кишечной палочки

Очищающий плазмидной ДНК из бактериальных колоний Использование Qiagen Miniprep Kit

Эта работа показывает, как форма РНК / ДНК гибридной на хромосомном уровне и выявить передачи генетической информации от РНК к геномной ДНК в клетках дрожжей.

Генерация РНК / ДНК гибридов в геномной ДНК с помощью преобразования с помощью РНК-содержащих олигонуклеотидов

Мы представляем процедура, посредством которой двумерной агарозном гель-анализ может быть использован для определения структуры репликации промежуточных, которые происходят следующие УФ-облучения.

Визуализация УФ-индуцированной репликации промежуточных Е. палочки Использование двумерных агарозном гель-анализа

Этот протокол представляет собой экономичную альтернативу для эффективных параллельных разъяснения и плазмиды очистки ДНК...

Упрощенная очистка плазмидной ДНК из Прокариотические культур

Здесь мы показываем, простой протокол для создания случайных мутантов библиотека для данной целевой последовательности. Мы покажем, как этот метод, который проводится в естественных условиях в кишечной палочки, могут быть связаны с функциональными выбор развиваться новые ферментативной деятельности.

Мутагенеза и функциональные Выбор протоколов для направленной эволюции белков в Е. палочки</em

Узнайте метод теплового шока для трансформации компетентных клеток E. coli с введением плазмидной ДНК. Этот надёжный подход применяется в молекулярной биологии и генной инженерии для подготовки бактерий к дальнейшим исследованиям.

Преобразование плазмидной ДНК в E.coli, с использованием метода теплового шока

Больше видео