Преобразование плазмидной ДНК в E.coli, с использованием метода теплового шока

Привет, меня зовут Алекс Хоге. Я работаю в тренажерном зале Hall Lab на кафедре физиологии и биофизики в Калифорнийском университете в Ирвине. И сегодня я покажу вам, как преобразовывать электрически грамотную кишечную палочку методом каждого удара.

Итак, сегодня я использую эту технику для трансформации кишечной палочки с помощью моего продукта, потому что я провожу эксперимент, чтобы провести целую монтировку у рыбок данио. Итак, мы начнем трансформацию. Итак, для начала вам нужно сделать свою водяную баню или сухой автобус при температуре 42 градуса.

Вам нужно, чтобы ваши бактерии, которые вы только что вывезли из главного города, были во льду. Сегодня мы используем клетки электрической компетентности, а также вашу ДНК во льду. Также вам понадобится тюбик с СОЦ при домашней температуре или 37 и ваши тарелки с ЛЖ плюс антибиотический фильтрующий материал.

Теперь я добавлю ДНК с бактериями. Поэтому я работаю рядом с пламенем, чтобы не заразить бактерии. Поэтому я добавляю лацию с бактериями.

Это 50 микролитров бактерий, а затем сразу же в лед вы можете немного взмахнуть им, чтобы смешать бактерии и вашу ДНК, и вы оставляете на 15 минут во льду. Итак, прошло 15 минут, и мы готовы к тепловому шоку, который заключается в том, чтобы нагреть бактерии до 42 градусов на 45 секунд. Итак, я вынимаю трубки изо льда прямо под углом 42 градуса, 30 таймер 45 секунд, а затем я очень быстро помещаю их обратно в лед и ставлю их из 42 градусов прямо на лед.

А потом ждем две минуты. Итак, теперь я собираюсь добавить среду SOC в бактерии и поместить их при температуре 37 на 30 минут. Итак, я испарил 500 микролитров среды SOC, поместил его в бактерии и поместил их в мою маленькую импровизированную камеру.

Поэтому, если вы собираетесь использовать для инкубатора трубки и импровизированную камеру, обязательно установите трубки горизонтально, потому что так они будут трястись гораздо лучше. Итак, теперь мы готовы поместить трубки в шейкер. Вот почему у нас есть эта маленькая камера при температуре 37 градусов на 30 минут.

Итак, теперь мы закончили инкубацию при 37 градусах, и мы собираемся поместить бактерии в фунт плюс антибиотики. Так что в моем случае это хлорал. Так по 50 микролитров каждого образца и выкладываю его на тарелку.

Так что с оставшимися 500 микролитрами вы раскручиваете их в маленькую столешницу, некоторые отказываются для того, чтобы очистить ее от бактерий. Итак, после ификации мы получаем хорошую гранулу, и теперь мы собираемся удалить почти все среды SOC, просто оставить 50 микролитров, а затем мы можем поместить эти 50 микролитров концентрированных бактерий. Так что я заплатил примерно 450 микролитров.

Я просто ухожу на этом. Итак, теперь я собираюсь подвесить поддон в 50 микролитровых остатках среды SOC. И после этого я могу налить эти 50 микролитров на другую тарелку.

Поэтому я сопротивляюсь каждой палетке, затем подгоняю ее и тарелку. Так что в итоге будет две пластины на образец. Итак, теперь нам нужно распределить бактерии по пластине LB.

Итак, я собираюсь использовать несколько автоклавных стеклянных шариков, но вы также можете использовать трубу, которую вы придаете форму распределителя, как этот. Итак, я собираюсь положить несколько бусин на чашку Петри. Мне нравится.

Ну, 10 15. Итак, после того, как вы добавили бусины, вы складываете все свои тарелки в стопку вот так и осторожно встряхиваете их, чтобы бусины равномерно распределили бактерии по тарелкам. Итак, когда я двигаю тарелки, пока они не высохнут.

А это значит, что вы не должны видеть больших полос жидкости при движении с бусинами. Например, на этой пластине бусины имеют тенденцию сворачиваться вместе и видеть много полос. Это пот, что бусины свободно двигаются, тот сухой.

Итак, теперь пластины высохли, поэтому мы можем выбросить бусины. Так что я просто делаю так, чтобы вы могли их переработать. Итак, теперь мы поместим тарелку в инкубатор на 37 на ночь, и вы поставите тарелки вверх дном, после 12 часов инкубации на 37 мы достаем тарелку из инкубатора.

И, как мы видим, у нас меньше колоний в тарелке, где я насыпаю 50 микролитров, чем в тарелке, где я накрывал остальное. При преобразовании бактерий важно иметь нужное количество колоний на вашей тарелке, правильную плотность. Итак, в этом месте у вас очень мало колоний, но если вы хотите больше колоний, вы можете иметь хороший пример в этой платформе, где плотность точно правильная, примерно 100 колоний на пластину.

Эта тарелка является плохим примером, потому что колоний слишком много, и вы не можете выбрать отдельные колонии. Итак, я только что показал вам, как трансформировать кишечную палочку при каждой трансформации. Таким образом, очень важным аспектом этой техники является сохранение всего или льда холодным до того, как произойдет шок.

Затем 45 секунд нормально, больше при 42 градусе обратно в лед. А все остальное должно быть при теплой температуре или 37 градусах. Так что теперь я собираюсь проверить свои колонии с помощью ПЦР-скрининга.

Так что один из пунктов также заключается в том, чтобы иметь две тарелки. Итак, во-первых, мы ожидаем, что колоний будет много, а этих колоний меньше. И что важно, чтобы ваши тарелки были очень сухими с помощью бусин или трубки.

Спасибо за просмотр и удачи с подтверждением.