Преобразование плазмидной ДНК в E.coli, с использованием метода теплового шока

Здравствуйте, я Алекс Хог. Я работаю в лаборатории Гим Холл на кафедре физиологии и биофизики Калифорнийского университета в Ирвайне. Сегодня я покажу вам, как проводить трансформацию электрокомпетентных клеток e coli методом электропорации.

Сегодня я использую данный метод для трансформации клеток E. coli моим продуктом лигирования, так как я планирую провести гибридизацию in situ на всём препарате у zebrafish. Итак, приступаем к трансформации. Сначала необходимо подготовить водяную или сухую баню, установив температуру 42 °C.

Бактерии, которые вы только что извлекли из основного стока, должны находиться на льду. Сегодня мы будем использовать электрокомпетентные клетки из итиев, а также вашу ДНК на льду. Кроме того, вам понадобится пробирка со средой SOC при комнатной температуре или 37 °C и чашки с питательной средой LB с добавлением антибиотика.

Теперь я добавлю ДНК к бактериям. Я работаю рядом с пламенем горелки, чтобы избежать контаминации бактерий. Таким образом, я вношу раствор с бактериями.

Добавьте 50 µL бактерий и немедленно верните пробирки на лед; можно слегка встряхнуть их, чтобы перемешать бактерии с вашей ДНК, и оставить на льду до 15 минут. Теперь, когда прошло 15 минут, мы готовы приступить к тепловому шоку, который заключается в выдерживании бактерий при 42 °C в течение 45 секунд. Я достаю пробирки изо льда и помещаю их непосредственно в термостат с температурой 42 °C, засекаю 45 секунд на таймере, после чего очень быстро возвращаю их на лед, перенося из среды с температурой 42 °C сразу на лед.

Затем мы выжидаем две минуты. Теперь я добавлю среду SOC к бактериям и выдержу их при 37 °C в течение 30 минут. Я добавляю 500 µL среды SOC к бактериям и помещаю их в свою небольшую самодельную камеру.

Таким образом, если вы планируете использовать пробирки типа «eend» и импровизированную камеру в качестве инкубатора, обязательно расположите пробирки горизонтально, так как при таком положении перемешивание будет происходить гораздо эффективнее. Теперь мы готовы поместить пробирки в шейкер. Именно для этого мы используем данную небольшую камеру при 37 °C в течение 30 минут.

Итак, инкубация при 37 °C завершена, и теперь мы приступим к высеву бактерий на среду LB с антибиотиками. В моем случае это хлорамфеникол. Я переношу по 50 µL каждого образца на чашку с агаром.

Оставшиеся 500 µL центрифугируют в настольной центрифуге, чтобы осадить бактерии. После центрифугирования мы получаем четкий осадок; теперь необходимо удалить почти всю среду SOC, оставив лишь 50 µL, после чего эти 50 µL концентрированной суспензии бактерий можно будет высеять на чашки. Таким образом, я удалил примерно 450 µL среды.

Я оставляю именно такой объем. Теперь я суспендирую осадок в оставшихся 50 µL среды SOC. После этого я смогу высеять данные 50 µL на другую чашку.

Затем я встряхиваю каждую пробирку, делаю посев и переношу культуру на чашки. Таким образом, в итоге получится по две чашки на образец. Теперь нам необходимо распределить бактерии по поверхности чашки с LB-агаром.

Я буду использовать стерилизованные в автоклаве стеклянные шарики, но вы также можете использовать пластиковую трубку, придав ей форму шпателя. Таким образом, я помещу несколько шариков в чашку Петри. Мне такой способ нравится.

Итак, 10 15. После добавления микросфер положите все планшеты стопкой таким образом и аккуратно встряхните их, чтобы микросферы равномерно распределили бактерии по всей поверхности планшетов. Затем перемещайте планшеты до их полного высыхания.

Таким образом, при перемещении гранул не должно быть видно больших полос жидкости. Например, на этой планшете гранулы склонны слипаться, и видно много полос. А вот здесь гранулы перемещаются свободно — значит, эта поверхность сухая.

Теперь, когда планшеты высохли, мы можем удалить магнитные частицы. Я просто вытягиваю их таким образом, чтобы их можно было утилизировать. Теперь мы помещаем планшет в инкубатор при 37 °C на ночь, при этом планшеты следует перевернуть. После 12 часов инкубации при 37 °C мы извлекаем планшет из инкубатора.

Как мы видим, на чашке, куда я высеял 50 µL, образовалось меньше колоний, чем на чашке, где был высеян остальной объем. При трансформации бактерий важно добиться правильного количества колоний на чашке, то есть подходящей плотности. В данном случае колоний очень мало, однако для получения большего количества можно использовать этот пример: на данной чашке плотность оптимальна и составляет примерно 100 колоний на чашку.

Эта пластина является неудачным примером, так как на ней слишком много колоний и невозможно выделить отдельные из них. Таким образом, я продемонстрировал вам способ трансформации e coli с помощью каждого метода трансформации. Очень важным аспектом данной методики является поддержание всех компонентов в охлажденном состоянии на льду до момента теплового шока.

Затем 45 секунд в обычном режиме, далее 42 °C, затем снова на лед. Все остальные этапы должны проходить при повышенной температуре или 37 °C. Теперь я приступлю к скринингу колоний с помощью ПЦР.

Таким образом, одна из целей также состоит в том, чтобы иметь две чашки. Ожидается, что на одной из них будет много колоний, а на другой — меньше. Важно, чтобы ваши чашки были очень сухими, что достигается с помощью использования бусин или пипеток.

Спасибо за просмотр и удачи в проведении подтверждения.