Расширение, очистки и функциональной оценки периферической крови человека клетки NK

Общая цель данной процедуры заключается в быстром экспансии большого количества NK-клеток человека. Начните ex vivo с выделения PBMC или NK-клеток из лейкоцитарного слоя или образца цельной крови. Затем проведите совместное культивирование PBMC с искусственными антигенпрезентирующими клетками для экспансии NK-клеток.

Среду дополняют IL-2 для поддержания культуры NK-клеток в течение трех недель с еженедельной стимуляцией с помощью аPC, стараясь поддерживать количество NK-клеток ниже 1×10⁶ на мл культуры. В конце концов функциональная эффективность экспандированных NK-клеток подтверждается с помощью нерадиоактивного анализа цитотоксичности. Типичный выход NK-клеток при данной схеме экспансии приводит к медианному увеличению количества NK-клеток в 21 000 раз по истечении 21 дня, при этом клетки обладают высокой цитотоксичностью в отношении различных опухолей, что определяется с помощью анализа высвобождения кальция.

Данный медицинский ролик поможет ответить на ключевой вопрос в области биологии NK-клеток, поскольку получение большого количества NK-клеток исторически было очень затруднительным. Этот метод имеет важное значение для иммунотерапии рака у людей, так как получение достаточного количества NK-клеток для такой терапии долгое время представляло серьезную проблему. Эту методику продемонстрирует Сесилия, старший научный сотрудник моей лаборатории: получение ПВМК из крови здоровых доноров.

Обычно в качестве источника используется лейкоцитарный слой (buffy coat) из банка крови. Сначала добавьте PBS, чтобы довести объем лейкоцитарного слоя до 140 milliliters. Затем нанесите 35 milliliters образца слоем на 15 milliliters fial PA для центрифугирования с градиентным разделением при 400 G в течение 20 minutes.

Без вскрытия слоя. Осторожно соберите П-МНК из интерфейса плазмы Fial PA и отложите пробирку с ЭЦК для последующего использования. Промойте П-МНК трижды с использованием PBS, центрифугируя каждый раз при 400 G в течение 10 минут.

Используйте эту фракцию ПМК (P BMCs) для экспансии NK-клеток. Теперь вернитесь к пробирке с градиентом. Аспирируйте верхний слой.

Перенесите эритроциты в две центрифужные пробирки объемом 50 мл и промойте, добавив PBS до метки 50 мл. После центрифугирования аспирируйте супернадант, снимая верхний слой эритроцитов, чтобы удалить гранулоциты.

Выполните три промывки, затем ресуспендируйте эритроциты в равном объеме раствора Элс и храните при температуре четыре градуса Цельсия до одного месяца. Эту фракцию эритроцитов можно использовать для очистки NK-клеток методом розеточной SEP по истечении двух недель экспансии. Для эффективной экспансии функциональных NK-клеток ex vivo используют клетки линии K 5 62 клона девять с мембранно-связанным IL 21, далее именуемые K 5 62.

Клон девять IL 21 используется в качестве искусственной антигенпрезентирующей клетки. Сначала подсчитайте количество PBMC и рассчитайте объем, необходимый для высева 5 × 10⁶ клеток для экспансии NK-клеток. На каждые 5 × 10⁶ PBMC облучите 10 × 10⁶ клеток K 5 62 клона девять IL 21. Облучение проводят в гамма-иррадиаторе при дозе 100 Gy; облученные клетки также можно заморозить для последующего использования. Теперь промойте предварительно облученные клетки раствором PBS и ресуспендируйте их в среде для экспансии NK-клеток.

Теперь добавьте облученные клетки в соотношении два к одному с PBMC в 40 мл среды для экспансии NK-клеток и поместите флакон T 75 вертикально в инкубатор при 37 °C и 5% CO2. На третий день соберите стимулированные клетки путем центрифугирования при 400 ×g в течение пяти минут, замените половину среды свежей NKEM и продолжайте культивирование. Повторите замену среды на пятый день. По истечении одной недели подсчитайте количество клеток и отберите 5 × 10⁵ клеток для фенотипирования методом проточной цитометрии; для второй стимуляции подсчитайте и облучите клетки K 562 в соотношении один к одному.

Клонируйте девять клеток IL 21 для экспансии, затем объедините клетки в среде для экспансии NK-клеток в концентрации 2,5 × 10⁵ клеток/мл. Разместите клетки во флаконах T 75 и продолжайте культивирование; на 10-й и 12-й дни проведите пассаж клеток в среде для экспансии NK-клеток в концентрации 2,5 × 10⁵ клеток/мл. На 14-й день экспансии снова подсчитайте количество клеток и проведите фенотипирование образца методом проточной цитометрии.

Очистите полученную экспансию клеток из PBMC, используя протокол очистки розеточками с помощью SEP, и подтвердите чистоту NK-клеток методом фенотипирования с помощью проточной цитометрии. Проведите третью стимуляцию очищенных NK-клеток, используя клетки клона девять K 5 62, облученные и обработанные IL 21, в соотношении один к одному. Наконец, на 21-й день проанализируйте амплифицированные NK-клетки методом проточной цитометрии с использованием полной панели антител для фенотипирования.

Заморозьте стоки клеток в FBS, содержащей 10% DMSO, с максимальной плотностью 5 × 10⁷ клеток на флакон. Для анализа цитотоксичности используйте либо свежие, либо замороженные NK-клетки. При использовании замороженных NK-клеток сначала разморозьте флакон с NK-клетками и высейте их в NKEM на 24 часа для восстановления клеток в день проведения анализа. Ресуспендируйте 10⁶ клеток-мишеней в 1 мл NKEM, содержащего calcium am, и инкубируйте в течение одного часа при 37 °C с периодическим встряхиванием. В U-образный 96-луночный планшет внесите в трех повторностях по 200 µL суспензии NK-клеток с концентрацией 1 × 10⁶ клеток/мл и выполните серийное разведение клеток согласно указаниям.

После одного часа нагрузки кальцием промойте клетки-мишени в среде для экспансии NK-клеток дважды, центрифугируя в течение пяти минут при 400 G. Затем заново подсчитайте клетки-мишени и ресуспендируйте их до концентрации 1 × 10⁵ клеток/мл. Добавьте по 100 µL клеток-мишеней в каждую лунку 96-луночного планшета и центрифугируйте в течение одной минуты при 100 G для обеспечения контакта клеток, затем инкубируйте при 37 °C и 5% CO2 в течение четырех часов.

Чтобы равномерно суспендировать высвобожденный кальций, осторожно перемешайте культуру, пипетируя осадок клеток при 100 G в течение пяти минут, и перенесите 100 µL супернатанта в новый плоскопадонный 96-луночный планшет, стараясь избегать образования пузырьков; при необходимости удалите возникшие пузырьки с помощью тонкой иглы. Проведите измерение планшета на флуориметрическом планшетном ридере с установкой фильтра возбуждения на 485 нм и фильтра эмиссии на 530 нм.

Рассчитайте процент специфического лизиса. Как правило, экспансия 5×10⁶ PBMC, выделенных из лейкоцитарного слоя (buffy coat), дает от 1×10⁹ до 10¹⁰ NK-клеток; при этом экспандированные NK-клетки экспрессируют различные NK-рецепторы, сопоставимые с теми, что экспрессируются в неэкспандированных первичных NK-клетках из лейкоцитарного слоя.

НК-клетки могут составлять от 2 до 18% PBMC на 14-й день. Очистка экспандированных клеток методом SEP-розеток позволяет выделить от 40 до 70% NK-клеток, присутствующих в культуре, при чистоте NK-клеток 99%, что подтверждается отсутствием CD3. Экспандированные NK-клетки (CD56-положительные и CD3-отрицательные) продемонстрировали цитотоксичность в отношении ряда линий опухолевых клеток, включая нейробластому, ОМЛ, остеосаркому и меланому.

Здесь представлен типичный результат цитотоксичности NK-клеток, выраженный в процентах специфического лизиса. На видео BIOT в реальном времени показано уничтожение NK-клетками нейробластомы клеточной линии CHP 1 34, нагруженной кальциумом, после проведения данной процедуры. Для получения ответов на дополнительные вопросы о функциях NK-клеток можно применить другие методы, такие как анализ продукции цитокинов NK-клетками и адаптивный перенос в моделях опухолей на животных.

После просмотра этого видео у вас должно появиться четкое представление о том, как экспандировать и очищать большое количество NK-клеток. Это можно осуществить либо напрямую из мононуклеарных клеток периферической крови с последующей очисткой NK-клеток, либо начать экспансию, используя NK-клетки, очищенные методом розеток. На начальном этапе типичный слой лейкоцитов (buffy coat) дает от 15 до 40 миллионов NK-клеток, все из которых могут быть использованы для получения очень большого количества NK-клеток согласно схеме, описанной в данном методе.