Простой способ определения этанола Чувствительность в Мухи

Здравствуйте, меня зовут Томас Мэйплс, я из лаборатории доктора Адриана Ротенфлю на кафедре психиатрии Медицинского центра Юго-Западного Техасского университета в Далласе. Сегодня я продемонстрирую простую процедуру определения чувствительности мух к седации этанолом. Данный анализ основан на потере мухами право запрашиваемого рефлекса и способности к передвижению после воздействия этанола.

Данный метод может быть использован для определения различий в чувствительности к алкоголю между различными штаммами drosophila и мутантами. Мы также можем использовать этот анализ для индукции толерантности у мух, под которой понимается снижение реакции на алкоголь после повторного воздействия. Приступим.

Для данного эксперимента вам понадобятся следующие пробирки. Возьмите восемь плодовых мушек, собранных за один или два дня до начала работы. Экспозицию можно проводить как с самцами, так и с самками.

Однако в каждом флаконе должен находиться только один пол. Пустой флакон с кормом, в котором нет мух, лезвие, две пробки для флаконов из хлопкоподобного материала. Если у вас нет таких пробок, можно использовать ватные шарики, микропипетку на 1000 µL с наконечниками, 200-процентный этанол с добавлением пищевого красителя, который можно приобрести в любом продуктовом магазине, и таймер.

Первым делом необходимо изготовить камеру для экспозиции, в которой мы будем подвергать мух воздействию этанола и отслеживать их подвижность. Для создания такой камеры сначала разрежьте пробку от флакона пополам с помощью лезвия бритвы. Затем вставьте одну из половинок на дно флакона, чтобы она закрыла корм.

Это создает ровную нелипкую поверхность, по которой могут передвигаться мухи. Если вы используете ватный тампон, аккуратно прижмите его, стараясь сделать поверхность максимально гладкой, чтобы мухи не застревали в волокнах ваты. При создании нескольких камер убедитесь, что корм и пробка виалы занимают одинаковый объем в каждой камере.

Это гарантирует, что мухи в каждой камере подвергаются воздействию этанола в одинаковом объеме. С опытом можно легко подвергнуть воздействию три виала с мухами параллельно. После подготовки камер для экспозиции можно приступать к воздействию этанола на мух.

Сначала перенесите флакон с восемью мухами в экспозиционную камеру, герметично закрыв камеру пробкой от флакона, в котором изначально находились мухи. Затем пипеткой нанесите 500 µL окрашенного этанола выбранной вами концентрации на один конец ватной пробки для флакона. После этого замените пробку экспозиционной камеры на пробку, смоченную этанолом, вставив конец, покрытый этанолом, внутрь камеры.

Сразу после помещения пробки, покрытой этанолом, в экспозиционную камеру запустите таймер. Краситель в этаноле помогает убедиться, что этанол обращен в сторону экспозиционной камеры, а не к стенке флакона. Это особенно важно при использовании ватных тампонов вместо специальных пробок (buzz plugs), так как любая сторона ватного тампона может быть обращена внутрь флакона.

В данном эксперименте мы используем 100% спирт, который диффундирует в камеру экспозиции, где мухи вдыхают его из воздуха. Каждую минуту после добавления в камеру экспозиции пробки, покрытой этанолом, мы будем подсчитывать количество мух, ставших неподвижными, что означает их неспособность перевернуться и передвигаться. Чем дольше мухи остаются мобильными, тем выше их устойчивость в каждом одномнутном интервале.

Спровоцируйте движение мух, постучав по камере о лабораторный стол, чтобы убедиться, что все способные к передвижению особи начали двигаться. Наблюдайте за мухами в течение 10 секунд после постукивания в каждом одноминутном интервале, чтобы дать им время начать движение или перевернуться. Зафиксируйте, сколько из восьми мух остаются неподвижными в начале эксперимента.

Большинство мух после испуга быстро забегают вверх по стенке флакона. После примерно шести минут воздействия 100% этанола они начинают двигаться вяло, а к 12-й минуте — иногда беспорядочно. Большинство мух становятся неподвижными, теряя способность ходить или перевернуться, если они оказались на спине.

К мобильным мухам следует относить только тех особей, которые способны самостоятельно перевернуться и передвигаться. Мухи, которые просто шевелят ногами или крыльями на месте, должны считаться неподвижными. Особей, которые на протяжении всего периода наблюдения остаются на спине, также следует считать неподвижными, так как неспособность перевернуться является признаком интоксикации. Мухи, которые интенсивно вибрируют крыльями в течение всего десятисекундного периода наблюдения, также должны считаться неподвижными, даже если они перемещаются. Подавляющее большинство таких мух остаются стационарными в перерывах между периодами быстрого движения крыльев.

Таким образом, мухи, способные перевернуться и передвигаться, считаются мобильными; мухи, которые не могут перевернуться, шевелят ногами и крыльями на месте или быстро вибрируют крыльями, считаются стационарными. Применяя эти правила, мы видим, что с увеличением времени воздействия паров этанола всё большее количество мух дикого типа переходит в стационарное состояние. Показателем, используемым в данном анализе для количественной оценки чувствительности к этанолу, является медианное время седации или MST.

Мы определяем MST как количество минут воздействия этанола, необходимое для того, чтобы четыре из восьми мух в камере экспозиции стали неподвижными. Это значение легко определить, если ровно четыре мухи остаются неподвижными в определенный период наблюдения. Например, если ровно четыре мухи неподвижны после 11 минут воздействия, то MST составляет 11.

Если ровно через 11 минут воздействия четыре мухи остаются неподвижными, и через 12 минут ситуация не меняется, то за основу берется первое значение, так как именно в это время мухи впервые достигают своего ST. Если в определенный период наблюдения четыре мухи не являются неподвижными, необходимо провести линейную интерполяцию времени, при котором четыре мухи стали неподвижными. Например, если количество неподвижных мух скачкообразно увеличивается с трех до пяти в интервале между девятой и 10 минутами воздействия, графически можно определить, что MST составляет 9.5. Следующие данные, полученные с помощью этого анализа, показывают, что данный дизайн эксперимента является точным способом измерения чувствительности к этанолу.

В следующих экспериментах использовалось от шести до восьми флаконов (N), что указано на столбцах. MST самцов мух дикого типа, подвергнутых воздействию 100% Ethanol, составляет примерно 11 минут с низкой стандартной ошибкой. Междневная вариабельность низка и в большинстве случаев статистически незначима, однако мы все равно рекомендуем измерять экспериментальные и контрольные группы параллельно в один и тот же день.

Также отметим, что мухи, подвергавшиеся воздействию в день A и день B, не являются одними и теми же особями. Это сибсы, представляющие одну и ту же генетическую линию; у самцов и самок мух, подвергавшихся воздействию 100% Ethanol, не наблюдалось различий в MST. Тем не менее, мы рекомендуем использовать особей только одного пола.

При воздействии на самцов и самок мух возрастающих доз этанола мы получаем четкую кривую дозозависимого ответа, которая демонстрирует статистически значимое снижение MST в зависимости от увеличения концентрации этанола. Данный анализ также воспроизводит ранее опубликованные фенотипы, измеренные с помощью более сложной установки для испарения этанола: мухи с мутацией right rabbit one показали значительное увеличение MST. Это увеличение наблюдалось как при 100%, так и при 90% этанола.

С помощью данного анализа мы также можем индуцировать и измерить толерантность к этанолу у мух. Толерантностью определяется снижение реакции на алкоголь после предварительного воздействия алкоголя для индуцирования толерантности. Поместите пробирку с мухами в среду с этанолом примерно на время, в два раза превышающее их MST.

Например, мы подвергаем самцов дикого типа из стока Berlin воздействию 100% ethanol в течение 24 минут. После этого осторожно переместите восемь мух обратно в виалу с кормом, где они должны находиться в состоянии восстановления в течение четырех часов. Зафиксируйте исходное MST мух на виале, затем, по прошествии четырех часов восстановления, снова подвергните тех же самых мух воздействию той же дозы ethanol и зафиксируйте их второе MST.

Как видно на этом графике, MST при втором воздействии этанола значительно выше, чем MST при первом воздействии, что указывает на развитие у мух толерантности к седативному действию этанола. Показатель толерантности рассчитывается путем деления второго значения MST для данной группы мух в виале на первое значение MST для тех же мух с последующим вычитанием единицы; полученное значение выражается в процентах толерантности, что в нашем случае составляет около 50%. Спасибо за просмотр и удачи в проведении вашего эксперимента.