Методы для быстрой передачи и локализации патогенов Болезнь Лайма В Tick Gut

Общая цель этой процедуры заключается в микроинъекции и локализации клеток borrelia berg de ferry в кишечнике клеща. Это достигается путем предварительной подготовки стеклянных капиллярных игл и заполнения их ячейками Беберга де Ферри. Затем клетки Беберга переносятся в кишечник клеща с помощью микроинъекции.

Затем клеща пресекают и удаляют ткани кишечника. Наконец, проводится иммунофлуоресцентное мечение по методу Беберга в кишечнике клеща. В конечном итоге можно получить результаты, которые демонстрируют локализацию beberg to ferry в кишечнике клеща с помощью конфокальной микроскопии.

Здравствуйте, я доктор Рут Пол Пол, доцент Университета штата Мэриленд на факультете ветеринарной медицины. Сегодня двое из моих сотрудников лаборатории Торо Каиро и аспирант Адам Коулман покажут вам процедуру искусственного заражения клещей с помощью микроинъекций, которую мы обычно делаем в лаборатории. После микроинъекции мы препарируем клеща и визуализируем бактерии в кишечнике клеща с помощью конфокального микроскопа CE.

Основным преимуществом микроинъекции клещей из поколения естественных инфицированных клещей является длительность процедуры. Микроинъекции сокращают всю процедуру с нескольких недель, так как требуется около пяти недель для создания инфицированных клещей в результате естественного процесса питания. Этот метод также может быть адаптирован для введения других полезных реагентов, таких как двухцепочечная РНК для РНК-интерференции или антисыворотки для специфической интерференции антител внутрь клеща.

Для начала изготовьте несколько микроинъекционных игл путем нагревания и втягивания в одну миллиметровую стеклянную капиллярную трубку в стеклянном микропипетном тянущем устройстве. Осторожно удалите хрупкие капиллярные трубки. Храните слипшиеся иглы кончиком вверх на скотче в чашке Петри.

Далее выращиваем b berg de ferry в культуре BSK. Среду до концентрации от 10 до 7 клеток на миллилитр гранулы b берг де ферри центрифугированием при 3000 G в течение 10 минут. При комнатной температуре удалите налет и полностью суспендируйте гранулу в среде BSK, осторожно пропустив через стерильный микронаконечник объемом 200 микролитров до конечной концентрации от 10 до девяти клеток на миллилитр.

Поскольку клетки ресуспендируются при высокой плотности клеток и могут слипаться, клеточную суспензию следует немедленно использовать для микроинъекций для подготовки клещей, наложить прозрачную двустороннюю клейкую ленту на предметное стекло, работающее на липком коврике, осторожно удалить клещей из контейнера С помощью небольшой кисточки поместить необходимое количество клещей на клейкую ленту брюшной стороной вверх вверх, обращенной в том же направлении. Загрузите пять микролитров культуры беберг де ферри в пул капиллярной иглы. Используя микронасадку наконечника пипетки объемом 20 микролитров, осмотрите иглу на наличие захваченных пузырьков воздуха и повторно загрузите иглу с бактериальной культурой.

При необходимости рассмотрите клеща под препарирующим бинокулярным микроскопом и сосредоточьтесь на области анального отверстия клеща. Осторожно коснитесь кончика капиллярной иглы, чтобы разорвать трубку, диаметр которой немного меньше, чем диаметр анального отверстия клеща, образующего иглу для микроинъекции. Этот шаг имеет решающее значение, так как любая попытка ввести клещей с неподходящими кончиками игл приводит к травмам и возможной смерти.

К введенному клещу. Поместите обездвиженных клещей под препарирующий бинокулярный микроскоп и сосредоточьтесь на анальном отверстии, которое закрыто двумя подвижными анальными пластинами. С помощью тонких щипцов осторожно коснитесь и очень мягко надавите на любую область рядом с анальным отверстием.

Это позволит отделить анальные пластинки и открыть анальную пору, которая соединяется с кишечником. Осторожно слегка введите кончик иглы в анальное отверстие через принудительное раскрытие анальных пластин. Введение иглы должно быть сведено к минимуму, так как стеклянный наконечник может повредить полупрозрачную заднюю кишку, которая соединяется с прямой кишкой.

С помощью микроинжектора, оснащенного автоматизированным ножным управлением, впрыск решения Беберга де Ферри используется по следующим параметрам. 1000 Гектора Паскаля давление впрыска 0,2 секунды время впрыска и восемь Гектора Паскаля компенсирующее давление. Каждый тик получает одну инъекцию после микроинъекции.

Клещ должен проявлять признаки движения или ползать в ответ на раздражители, как и до инъекции. Чтобы препарировать клещей для иммунофлуоресцентной микроскопии, сначала поместите каплю фосфатно-солевого буфера на чистое предметное стекло для вскрытия, а другую — на предметное стекло, покрытое поли-Lлизином Для микроскопии подготовьте еще одно предметное стекло с помощью двусторонней клейкой ленты. Далее извлеките клеща из контейнера и поместите его на двусторонний скотч.

С помощью небольшой кисточки под микроскопом для вскрытия и сфокусируйтесь на клеще, поместите острое лезвие бритвы на клеща между первой и второй парами ног. Плотно придавите, разрезав клеща на две части, обнажив брюшную полость, сразу же погрузив брюшную полость в каплю PBS с помощью тонких щипцов. Захватите спинной и брюшной экзоскелет вокруг места разреза.

Осторожно потяните спинной щиток вверх и в сторону от клеща, обнажив коричневатый цвет кишечного дивертикуляра. Будьте осторожны, чтобы рассекающие клещи всегда находились под PBS. Полупрозрачные пучки салевых желез расположены по обе стороны от передней области кишечника и при желании могут быть удалены на этом этапе.

Удерживая оставшийся экзоскелет на месте щипцами, осторожно вытащите кишку из брюшной полости. Тщательно очистите кишечник, удалив все застрявшие ткани, такие как трахии. С помощью кончика тонких щипцов быстро перенесите кишку клеща в каплю PBS на предметное стекло с поли L лизином.

Разделите кишку на более мелкие кусочки с помощью тонких лезвий или осторожного надавливания кончиком тонких щипцов. Осторожно аспирируйте избыток PBS вокруг тканей кишечника. Дайте тканям кишечника нагреться на воздухе до сухой комнатной температуры.

Исправьте кишечник клеща, погрузив его в ацетон на 10 минут. Дайте ему высохнуть на воздухе, предметные стекла при комнатной температуре можно хранить на этом этапе в течение нескольких месяцев при температуре минус 20 градусов Цельсия в герметичном контейнере. Для иммунофлуоресцентного мечения кишечника нарисуйте круг вокруг неподвижной кишки клеща с помощью пап-ручки или другого гидрофобного барьерного выстилающего устройства.

Это поможет сохранить окрашивающие растворы на последующих этапах инкубации. Накройте кишечник клеща одной или несколькими каплями блокирующего буфера на 30 минут. При комнатной температуре.

Сыворотка, используемая для блокирования, зависит от источника антител у животного-хозяина. Не допускайте высыхания предметного стекла с этого момента и далее. Медленно отсасывайте блокирующий буфер.

Инкубируйте кишечник с соответствующими первичными и/или вторичными растворами антител. Мы используем флуоресцеин, изотиоцианат или FXI, меченный анти Bberg. Отложите разведение антител в соотношении от одного до 100 в блокирующем буфере на один час.

При комнатной температуре накройте емкость алюминиевой фольгой, чтобы ограничить воздействие света. Удалите раствор антитела с помощью щадящей аспирации. Инкубируйте кишечник с флуоресцентным красителем, чтобы пометить ткани клещей, таким как DPI или йодид пропидия.

Обычно мы используем 20 микрограммов на миллилитр йодида перидия в PBS в течение пяти минут при комнатной температуре, стираем три раза с 0,05% tween 20 в PBS в течение пяти минут. Наконец, установите предметное стекло в буферный глицерин, содержащий реагент Antifa, и осторожно накройте стеклянной крышкой. Слайды могут храниться на этом этапе в течение нескольких месяцев при температуре четыре градуса Цельсия в герметичном контейнере и локализоваться под конфокальным микроскопом.

Здесь показана микроинъекция клеща с помощью иглы, наполненной бриллиантовым синим цветом кумаси для видимости. Тонкие щипцы используются для мягкого давления на тело, что позволяет отделить анальные пластины и открыть анальную пору для микроинъекций. Здесь показана передняя область дивертикула кишечника с ферром Беберга в кишечнике.

Ядра кишечника и спирохеты помечены йодидом пропидия или фитзи конъюгированным антибеберговым ферри соответственно. После освоения мы обнаружили, что 10 клещей могут быть микроинъекции силы, естественно, сто тысяч выживут и будут заражены фером. В то время как клещи могут быть немедленно использованы для других экспериментов, мы обычно ждем один или два дня, чтобы убедиться, что клещи выживут после процедуры, прежде чем продолжить.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как создавать искусственных инфицированных клещей с помощью микро- и локализованной барьерной бактерии в кишечнике клеща с помощью конфокальных иммунологических потоков. Микроработа с клещами и тонкими стеклянными иглами, наполненными человеческим патогеном, таким как мальки бриара brelia, может быть опасной во время работы. Следите за местонахождением клещей и игл и всегда соблюдайте меры предосторожности второго уровня биобезопасности.

Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.