Использование люциферазы в Изображение Бактериальные инфекции у мышей

Методы визуализации биолюминесценции бактериальных инфекций в живых животных, описаны. Патогенные изменен, чтобы выразить люциферазы позволяет оптическим целого изображения тела инфекций у животных. Экспериментальные модели на животных могут быть инфицированы люциферазы выражения патогенов и в результате течения заболевания визуализированы в реальном времени биолюминесценции изображений.

Общая цель данного эксперимента заключается в получении количественного изображения инфекции у живых животных, которое может позволить локализовать инфицирующий организм в тканях и органах хозяина. Мышей, находящихся под наркозом, сначала интрахеально заражают биолюминесцентными бактериями. Затем инфицированным мышам вводят люцифериан, который позволяет проводить живую визуализацию в системе IVIS.

После того, как получены изображения всего тела, у инфицированных легких собирают материал. Визуализация выделенных органов может быть выполнена для демонстрации истинной локализации возбудителя. После визуализации легкие гомогенизируются и разбавляются на бактериальной питательной среде для количественной оценки микробной нагрузки.

В конечном итоге получаются результаты, которые показывают местоположение и количество патогенов, присутствующих в организме хозяина в режиме реального времени. Основное преимущество этого метода по сравнению с существующим методом заключается в том, что патогены могут быть визуализированы и контролироваться у живых животных с помощью визуализации в реальном времени, что дает представление о пространственных тиках микробной инфекции. Эту процедуру будут демонстрировать доктор Михи Чанг, научный сотрудник моей лаборатории, и спецназ Силло, исследователь в моей лаборатории.

Начните с внутрибрюшинного введения мышам в возрасте от 6 до 12 недель предварительно смешанного анестетика, содержащего 100 микрограммов кетамина и 10 микрограммов ксилазина на грамм веса мыши. Поместите мышей обратно в клетки, пока анестетик не подействует. Чтобы определить, является ли анестезия полной, сожмите подушечку лапы каждой мыши и убедитесь, что рефлекторная реакция педалей не происходит.

Как только животные будут полностью обезболены, возьмите одну мышь и поместите ее на интубацию. Встаньте лежа на его спине. С помощью скотча закрепите ножки и руки мыши на подставке.

Закрепите резиновую ленту на стойке для интубации. Затем поместите его под верхние резцы мыши. После того, как мышь будет обездвижена, с помощью щипцов осторожно вытяните язык изо рта.

Далее аккуратно введите зеркало с отоскопом внутрь рта мыши и найдите отверстие гортани, которое находится перед пищеводом на вентральной стороне ротоглотки. После того, как отверстие гортани будет определено, вставьте в трахею катетер 22 калибра размером один дюйм, содержащий направляющую проволоку, до тех пор, пока концентратор катетера не достигнет резцов. Снимите направляющий провод и подсоедините катетер к пластиковому насосу.

Затем нагнетайте воздух в катетер. Грудная клетка мыши будет надуваться, если интубация проведена правильно. После того, как будет подтверждено правильность установки катетера, введите пипеткой 50 микролитров биолюминесцентного бактериального раствора в желаемой концентрации в катетер и присоедините одномиллилитровый шприц с 50 микролитрами воздуха, чтобы протолкнуть раствор в легкие мыши.

Два или три раза извлеките катетер и поместите мышь обратно в клетку, чтобы она могла восстановиться после анестезии. Перед проведением биолюминесцентной визуализации обезболивают мышей с помощью изофлурана. Как только мыши будут полностью обезболены, извлеките их из индукционной камеры и аккуратно нанесите оптическую мазь для защиты глаз животного.

Во время визуализации поместите мышей в камеру визуализации каждого из носовых конусов на анестезиологическом коллекторе. Используйте световую перегородку между мышами, чтобы предотвратить отражение света между соседними объектами животного. Наконец, введите каждой мыши внутрибрюшинно 150 микрограммов на грамм массы тела Люцифера.

Дайте Люциферу рассеяться по всему телу животного в течение 10 минут. Затем приступайте к визуализации. Запустите программное обеспечение для визуализации живых животных и инициализируйте систему визуализации IVIS.

Чтобы сначала задать параметры, нажмите на кнопку «Настройка последовательности». Затем выберите режим люминесценции и фотосъемки. Выберите фотографические люминесцентные и структурные световые изображения как часть последовательности изображений, чтобы обеспечить 3D-реконструкцию DLIT.

Далее установите время выдержки равной одной минуте. Затем установите группировку на среднюю, а F-ступень на единицу. Установите фильтр возбуждения на блокировку, а фильтры излучения на открытие для 3D-реконструкции включите несколько фильтров с разными длинами волн.

Чтобы обеспечить точную локализацию источника сигнала, выберите поле зрения, соответствующее количеству визуализируемых мышей. После того как все настройки будут определены, нажмите кнопку «Добавить» в мастере изображений на панели управления сбором данных, чтобы добавить настройку последовательности, и нажмите кнопку «Получить», чтобы начать последовательность изображений во время сбора. Запишите детали эксперимента и условия в окне редактирования изображения и сохраните изображения.

Наконец, извлеките мышей из камеры визуализации и верните их в клетки. Постоянно наблюдайте за животными до тех пор, пока они не оправятся от анестезии. Для визуализации тканей гуманно усыпьте мышей.

На этом этапе асептически соберите легкие каждой мыши и перенесите органы в стерильную чашку Петри. Поместите чашку Петри, содержащую инфицированные легкие, внутрь камеры визуализации и получите биолюминесцентные изображения таким же образом, как описано ранее в этом видео. После получения изображений извлеките чашку Петри из камеры визуализации и с помощью стерильных щипцов перенесите легкие в трубку, содержащую один миллилитр стерильного PBS, с помощью гомогенизатора гомогенизируйте легкие в течение двух-пяти минут.

Готовят серийное разведение гомогенатов легких в стерильных PBS. Затем налейте по 100 микролитров каждого разбавления на чашки Петри, содержащие селективную среду. Инкубируйте культуры при температуре 37 градусов Цельсия до тех пор, пока колонии бактерий не станут четко видны.

Затем посчитайте КОЕ, чтобы оценить уровень инфекции. Запустите программу для работы с живыми изображениями и откройте нужные файлы изображений из файлового браузера. В палитре инструментов.

Нажмите на настройку изображения, чтобы изменить настройки коррекции и фильтрации, а также пороговые значения цветовой шкалы. Чтобы количественно оценить интенсивность люминесценции, используйте инструменты «Область интереса» или «ROI» из раскрывающегося списка, выберите количество и размер формы ROI. Затем нажмите на «Измерение ROI» и сохраните выходные количественные данные для реконструкции 3D-изображений.

Во-первых, загрузите последовательность изображений, включая изображения структурированного света. Нажмите на топографию поверхности в палитре инструментов. Затем в раскрывающемся списке выберите вкладку Реконструкция, чтобы создать топографию поверхности.

Затем выберите DILT 3D реконструкцию на палитре инструментов. Перейдите на вкладку «Свойства» в раскрывающемся списке и установите свойства тканей и спектр источника на мышцы. Перейдите на вкладку анализа и выберите длину волны для анализа.

Затем нажмите «Начать». После того, как все настройки будут отрегулированы, нажмите «Реконструкция», чтобы начать 3D-анализ. Когда 3D-реконструкция будет завершена, выберите 3D-вид для отображения результатов, щелкнув вкладку результатов, можно просмотреть плотность фотонов, воксели данных и параметры алгоритма, сохраните результаты и экспортируйте данные и изображения для дальнейшего анализа.

Как показано на этом рисунке, две мыши справа, которые были внутритрахеально инфицированы от 10 до 6 КОЕ биолюминесцентных бактерий, производят сильный сигнал из легочной области, в то время как неинфицированная мышь слева этого не делает. Аналогичный анализ, проведенный с использованием вскрытых легких инфицированных мышей, подтверждает, что люминесценция исходит из легких, а не из какой-то другой близко прилегающей ткани. Сигнал, исходящий от образца, может быть легко количественно определен как общий поток в пределах интересующей области.

Томографический анализ подтверждает, что положение люминесценции, отображаемой на этих изображениях в виде красных прямоугольников, попадает в область, содержащую легкие мыши, как это определено с помощью 3D-реконструкции. Наконец, сходство между измеренной кривой плотности фотонов слева и смоделированной кривой плотности фотонов справа свидетельствует о хорошем качестве реконструкции. После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать, как изображать животных, зараженных прецедентом, и анализировать изображения для локализации и количественной оценки воспоминаний.