Прижизненные микроскопия пахового лимфатического узла
4 апреля 2011 г.
Техника для выполнения прижизненной микроскопии паховых лимфатических узлов (ЛУ) описана. Такая методика позволяет в режиме реального времени, В естественных условиях Изучение микроциркуляторного лимфатических узлов и структура как во время гомеостаза и инфекции. Эта техника может быть адаптирована для исследования клетка с торговлей людьми и другими сайтами лимфатических узлов.
Общая цель данной процедуры — визуализация и оценка питающей артерии пахового лимфатического узла in vivo. Это достигается путем создания кожного лоскута посредством осторожного рассечения кожи в паховой области мыши, покрывающей паховый лимфатический узел. Затем отделяют соединительную ткань, перекрывающую область лимфатического узла.
Затем необходимо удалить окружающую жировую ткань, чтобы обнажить питающие артерии лимфатического узла. Наконец, изменения в сосудистой сети лимфатического узла визуализируют и оценивают с помощью интравитальной микроскопии P. Хотя сегодня вы увидите препарат микроциркуляции пахового лимфатического узла, данные хирургические методы могут быть использованы и для других препаратов, таких как скелетные мышцы или головной мозг.
Как правило, при освоении данной методики новички сталкиваются с трудностями по двум основным причинам. Во-первых, работа ведется с живым животным, а во-вторых, поскольку хирургическое вмешательство проводится на очень ограниченном участке, любые повреждения самого сосуда или окружающих тканей могут оказать негативное влияние, что станет критичным для проведения планируемого эксперимента. Визуальная демонстрация данной техники имеет решающее значение для достижения успеха.
Данный метод включает в себя ряд сложных этапов, которые трудно передать только с помощью текста. Для правильного выполнения техники крайне важно увидеть процесс наглядно. Желаем вам больших успехов.
Сначала мышь наркотизируют, а область хирургического вмешательства выбривают. Подробную информацию см. в текстовой рукописи. После этого мышь помещают на прозрачную хирургическую доску в положении на спине.
Закрепите мышь на доске, приклеив каждую подушечку лап с помощью ленты. За день до эксперимента приготовьте смесь Thes Guard 180 4 согласно инструкциям производителя. Затем, используя стандартную одноразовую чашку Петри в качестве формы, разлейте смесь слоем толщиной примерно одну четверть дюйма и оставьте до полного отверждения на ночь. Извлеките Thes Guard из чашки Петри и поместите его на хирургическую доску.
Поместите выбритую анестезированную мышь под диссекционный микроскоп. Сделайте срединный разрез по вентральной поверхности брюшной полости, используя стальные пинцеты номер пять и прямые пружинные ножницы. Затем продолжите срединный разрез по диагонали в направлении конечностей и отведите кожу в сторону массивного позвоночного столба.
Как только ln станет четко виден, закрепите отодвинутую кожу на сигарообразном четырехточечном пьедестале 180 с помощью энтомологических булавок из нержавеющей стали и инокс-пинцетов с эпоксидным покрытием. Добавьте в эту область физиологический раствор или PSS.
Затем удалите тонкий слой соединительной ткани, перекрывающий область вокруг лимфоузла. С помощью пинцета осторожно захватывайте небольшие фрагменты соединительной ткани и отделяйте их от лимфоузла. Затем с помощью пружинных ножниц удалите жировую ткань, перекрывающую и окружающую лимфоузел, пока не обнажится микрососудистое русло.
На этом этапе важно соблюдать осторожность, чтобы не допустить контакта хирургических инструментов с исследуемой сосудистой сетью и не повредить сосуды чрезмерным давлением при манипуляциях с окружающими их тканями. Жировую ткань вокруг ln лучше всего удалять, разрыхляя соединительную ткань и удерживая жировую ткань пинцетом, после чего осторожно удалять жировую ткань до полной очистки поля зрения. После удаления соединительной и жировой тканей можно визуализировать основной артериальный сегмент, прилегающий к LN, и перекрывающую его сопровождающую ven.
После того как интересующий сегмент сосуда был обнажен под диссекционным микроскопом, закрепите препарат на интравитальном микроскопе. Подготовьте линии суперфузии и аспирации. На этом этапе процедуры крайне важно, чтобы обнаженная ткань постоянно находилась под суперфузией уравновешенным раствором PSS.
Суперфузия PSS осуществляется за счет силы тяжести. Раствор подается из начального резервуара в резервуар с водяной рубашкой, который продувается смесью 5% Carbon dioxide и азота, затем по капельной линии со скоростью 10 milliliters в минуту. Для постоянного удаления суперфузионного PSS от препарата следует использовать аспирационную линию, расположив ее у основания кожного лоскута; затем необходимо проверить и отрегулировать температуру циркулирующей водяной бани и скорость суперфузии PSS для достижения оптимальной температуры около 36 °C.
В процессе подготовки дайте сосудистой системе уравновеситься с PSS в течение как минимум 60 минут. С помощью ректального термометра следите за тем, чтобы у животного не развилась гипотермия, и используйте внешнюю тепловую лампу. Пока PSS уравновешивается, измерьте диаметр сосуда.
Используйте видеоциркуль в несколько моментов времени, чтобы убедиться в стабилизации сосуда; стабилизация определяется как сохранение неизменного диаметра в пределах 5 µm в течение 20 минут. Измерения диаметра регистрируются на компьютере с помощью программного обеспечения ChartLab. После периода уравновешивания оцените состояние сосуда, используя специфический агонист гладких мышц, например фенилэфрин, как показано здесь с применением фенилэфрина.
Добавьте агонист в систему. На каждом логарифмическом шаге увеличения кумулятивной концентрации агониста, вводимого в систему, следует оценить восемь агонистов. Проведите фазу промывки с использованием PSS в течение 30 минут или до возвращения сосуда к исходному диаметру покоя.
Ниже представлены репрезентативные результаты исследования пахового лимфатического узла после периода стабилизации. Введение физиологического раствора в артерию обеспечивает четкое изображение, позволяющее идентифицировать как питающую артерию (отмечена красной стрелкой), так и вену (отмечена зеленой стрелкой), которые снабжают паховый лимфатический узел. На графике показан типичный вазоактивный ответ питающей артерии пахового лимфатического узла на кумулятивное добавление фенилэфрина к физиологическому раствору.
В диапазоне концентраций от 10⁻⁹ M до 10⁻⁵ M выраженная вазоконстрикция свидетельствует о нормальной функции гладких мышц артерии. На данном графике представлен типичный вазоактивный ответ на кумулятивное добавление ацетилхолина к физиологическому раствору в диапазоне концентраций от 10⁻⁹ M до 10⁻⁵ M.
Наличие выраженной вазодилатации свидетельствует о нормальной функции эндотелия артерии. При подготовке данного препарата крайне важно помнить о необходимости минимизировать воздействие на сосуд и окружающие ткани для достижения максимального успеха. После выполнения этой процедуры можно применить другие методы, например, флуоресценцию, для изучения других клеточных функций, таких как транспорт клеток.
Разработка данного метода позволила объединить иммунологию и биологию сосудов в новую область — сосудистую иммунологию.
Обзор
В данной статье описывается методика проведения интравитальной микроскопии пахового лимфатического узла, позволяющая в режиме реального времени in vivo изучать микрососудистую сеть и структуру лимфатического узла в состоянии гомеостаза и при инфекции. Данный метод может быть адаптирован для исследований миграции клеток и изучения других лимфатических узлов.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Микрососудистая визуализация
- Интравитальная микроскопия
Теоретические основы
- Интравитальная микроскопия позволяет визуализировать живые ткани.
- Паховый лимфатический узел имеет решающее значение для исследований иммунного ответа.
- Понимание особенностей сосудистой сети лимфатических узлов важно для различных биологических исследований.
- Данные методы могут быть применены к другим тканям, таким как скелетные мышцы и мозг.
Цель исследования
- Визуализация и оценка питающей артерии пахового лимфатического узла in vivo.
- Оценка изменений сосудов лимфатического узла при различных физиологических состояниях.
- Предоставление подробного процедурного руководства для исследователей.
Используемые методы
- Создание кожного лоскута для обнажения пахового лимфатического узла.
- Диссекция соединительной и жировой тканей, окружающих лимфатический узел.
- Использование интравитальной микроскопии для визуализации микрососудистого русла.
- Введение физиологического раствора для обеспечения оптимальных условий визуализации.
Основные результаты
- Успешная визуализация сосудов пахового лимфатического узла.
- Демонстрация нормальной функции гладких мышц при артериальном ответе.
- Количественная оценка стабильности диаметра сосудов.
- Четкая идентификация артериальных и венозных структур, кровоснабжающих лимфатический узел.
Выводы
- Данный метод позволяет получить важные сведения о микроциркуляции в лимфатических узлах.
- Визуальные демонстрации способствуют лучшему пониманию сложных этапов хирургического вмешательства.
- Этот метод может быть адаптирован для различных вариантов дизайна экспериментов в области биологии сосудов.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Интравитальная микроскопия пахового лимфатического узла позволяет в режиме реального времени визуализировать микрососудистую динамику, имеющую решающее значение для понимания миграции иммунных клеток и сосудисто-иммунных взаимодействий. Этот метод способствует снижению механистических рисков на ранних этапах поиска новых мишеней, обеспечивая количественные функциональные показатели состояния сосудов и их реактивности в физиологических условиях. Он объединяет иммунологию и биологию сосудов, представляя прогностическую ценность для валидации мишеней в рамках разработки препаратов для лечения воспалений, инфекций и в сфере иммуноонкологии.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишеней
- Научная ценность: позволяет проверить терапевтические гипотезы путем визуализации микрососудистых ответов на вазоактивные агенты в режиме реального времени, что способствует функциональной валидации мишеней.
- Практическая ценность: обеспечивает количественное измерение диаметра сосудов, которые служат воспроизводимыми биомаркерами сосудистой функции в моделях заболеваний.
- Прогностическая значимость: позволяет оценить функцию гладких мышц и эндотелия, что помогает снизить риски при выборе мишеней, участвующих в регуляции сосудов и привлечении иммунных клеток.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Подготовка валидированных биологических систем для последующих этапов анализа путем установления базовой сосудистой функции и стабильности перед тестированием соединений.
- Практическая ценность: Обеспечение стандартизации анализа с помощью контролируемых протоколов суперфузии и критериев стабилизации (диаметр в пределах 5 µm в течение 20 min), что гарантирует надежность оценки соединений.
- Масштабируемость: Возможность проведения лонгитюдного имиджинга в течение нескольких часов, что облегчает оценку временизависимых ответов в кампаниях по скринингу.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Обеспечивает непрерывность процесса от этапа открытия до доклинической валидации, позволяя осуществлять лонгитюдный мониторинг сосудистых реакций в моделях, релевантных конкретному заболеванию.
- Операционная ценность: Поддерживает принятие решений о продвижении проекта с учетом рисков путем количественной оценки функциональности сосудов, которая является ключевым определяющим фактором эффективности иммунного ответа в лимфатических узлах.
- Соответствие трансляционным биомаркерам: Диаметр и реактивность сосудов служат трансляционными биомаркерами, коррелирующими с трафиком иммунных клеток и функцией лимфоузлов.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод интегрируется в общий процесс поиска — от проверки гипотез до идентификации ведущих соединений, обеспечивая функциональные показатели сосудов, которые позволяют обосновать выбор мишени и понять механизмы действия.
- Фундаментальная биология: способствует проверке гипотез и уточнению сигнальных путей, обеспечивая возможность прямого наблюдения за интерфейсами между микрососудами и иммунными клетками в состоянии гомеостаза и при воздействии внешних факторов.
- Скрининг: обеспечивает готовность анализа за счет стабилизированных сосудов и количественных показателей (диаметр, реактивность), позволяющих проводить сравнение различных экспериментальных условий.
- Аналитика: позволяет получать измеримые результаты, включая изменение диаметра сосудов и ответы по типу вазоконстрикции/вазодилатации, что обеспечивает возможность статистического сравнения эффектов терапии.
- Трансляционные исследования: обеспечивают преемственность с доклиническими исследованиями путем моделирования вклада сосудов в иммунный ответ, что актуально для разработки адъювантов и иммуномодуляторов.
- Корпоративное использование: создает многократно используемую платформу для прижизненной визуализации, применимую для различных участков лимфатических узлов и моделей заболеваний, что максимально эффективно использует инвестиции в инфраструктуру.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: обеспечивает прогностическую уверенность в валидации мишеней за счет снижения механистической неопределенности во взаимодействии между сосудистой и иммунной системами.
- Операционная ценность: гарантирует стандартизацию и воспроизводимость за счет контролируемой суперфузии, регулирования температуры и критериев стабилизации.
- Стратегическая ценность: улучшает процесс принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go), предоставляя функциональные данные о сосудах, что снижает биологические риски на поздних этапах иммуномодулирующих программ.
- Влияние на портфель: позволяет проводить приоритизацию мишеней с учетом рисков на основе данных о функциональности сосудов, что способствует экономически эффективному продвижению проектов.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области микрохирургии и прижизненной визуализации для минимизации повреждения сосудов при подготовке тканей.
- Зависит от наличия установки для прижизненной микроскопии с линиями суперфузии и отсоса для обеспечения стабильных условий визуализации.
- Необходима межкомандная стандартизация протоколов количественного анализа сосудов (например, измерение диаметра с помощью видеоциркулятора) для получения воспроизводимых результатов.
- Требуется адаптация методики при ее применении к другим лимфатическим узлам или тканям, таким как скелетные мышцы или головной мозг.
- Ограничено технической сложностью поддержания жизнеспособности сосудов в течение длительных периодов визуализации, что требует тщательного контроля температуры и перфузии.
