Оценка сигнализации Свойства эктодермальная эпителия Во время черепно-лицевых развития

Общая цель данной процедуры заключается в создании химерных эмбрионов путем трансплантации эктодермы из донорских эмбрионов в развивающуюся верхнюю челюсть эмбрионов цыпленка. Это достигается путем предварительного удаления донорской дермы для последующей трансплантации. Затем место реципиента подготавливают к приживлению трансплантата.

Заключительным этапом процедуры является помещение донорской ткани на участок реципиента и фиксация трансплантата на месте. В конечном итоге можно получить результаты, демонстрирующие исключительное приживление донорской эктодермы, а с помощью молекулярного и морфологического анализа определить функцию донорской рекодированной дермы. Данный метод может помочь ответить на ключевые вопросы биологии развития, такие как определение роли различных тканей в процессе морфогенеза.

Процедуру продемонстрирует доктор Дайан, старший исследователь нашей лаборатории. Перед началом данной процедуры приготовьте среды и убедитесь, что все необходимые растворы доступны и имеют правильную температуру. Затем, используя соответствующие средства защиты глаз, вытяните микрокапиллярные трубки до образования тонкого кончика над пламенем спиртовой горелки.

Для затачивания вольфрамовых игл используйте стеклянные штифты, удерживая иглы в пламени пропанового горелки. Начните извлечение донорского эмбриона из скорлупы, наклеив кусочек скотча на конец яйца. Затем с помощью кончика диссекционной иглы сделайте маленькое отверстие в центре скотча.

Введите в отверстие шприц объемом 10 мл с подкожной иглой 18 G и извлеките из яйца 1 мл альбумина. Затем с помощью препаровальной иглы сделайте небольшое отверстие в верхней части скорлупы. Наклейте второй кусочек скотча, чтобы закрыть это отверстие.

С помощью двух пар пинцетов прорежьте в яйце круглое отверстие. Захватите эмбрион и перенесите его в чашку с ледяным раствором PBS для промывки. После удаления головы эмбриона поместите его в чашку для культивирования тканей, содержащую DMEM без сыворотки при комнатной температуре.

Поместите чашку под диссекционный микроскоп, удерживая голову пинцетом. С помощью пружинных ножниц проведите грубую диссекцию верхней челюсти и лагона, отделив их от остальной части головы. Затем, используя держатель с острым лезвием бритвы, удалите фронтоназальный отросток от верхней челюсти.

С помощью пипетки перенесите фронтоназальный отросток в чашку Петри диаметром 30 мм, содержащую достаточный объем диспазы в PBS, и инкубируйте на льду в течение 20 минут. По истечении времени инкубации аспирируйте раствор диспазы, не повреждая ткань. Затем полностью залейте ткани средой DMEM с добавлением 1% BSA.

Чтобы остановить процесс дигестии, перенесите ткань в новую культуральную чашку. Затем, работая под диссекционным микроскопом, зафиксируйте ткань незаточенной вольфрамовой иглой, используя заточенную вольфрамовую иглу.

Отделите эктодерму, аккуратно отслаивая ее от остальных тканей. После подготовки поместите ткань трансплантата в среду DMEM с BSA на лед до момента готовности реципиента к трансплантации. Используя ранее продемонстрированный метод, сделайте окно в курином яйце.

Поместите яйцо с эмбрионом под диссекционный микроскоп, используя два пинцета. Захватите мембрану IGN и амнион, аккуратно разорвите их, чтобы сделать отверстие и обнажить эмбрион хозяина. Поверните голову, поместив один пинцет на правый глаз и приложив давление, удерживая голову неподвижно.

С помощью пинцета и иглы удалите дерму реципиента, чтобы освободить место для трансплантата. Добавьте 2 µL нейтрального красного в чашку Петри с подготовленными трансплантатами. С помощью стеклянной пипетки перенесите трансплантат на реципиента.

Поместите трансплантат на место удаленного эктодермы. После имплантации зафиксируйте трансплантат, вставив стеклянный штифт в каждый угол пересаженной ткани. Плотно закройте окно с помощью клейкой ленты.

Верните эмбрион в инкубатор до достижения стадии развития, необходимой для анализа. На данном изображении представлена ткань мочеточникового отростка (URA) цыпленка перепела, окрашенная специфическими для перепела антителами к Q-C-P-N-A. Пересаженная ткань находится между двумя стрелками. Признаков окрашивания QCPN в тканях химеры мышь-цыпленок не наблюдается. Здесь снова пересаженная ткань расположена между двумя стрелками; в C2 представлена гибридизация с зондом, специфичным к повторяющейся последовательности B2.

Зеркальное отображение генов первого класса показывает, что экспрессия sign B two ограничена областью, включающей трансплантат, представленный здесь на изображении химеры цыпленка и перепела, окрашенной трихромным методом; трихромное окрашивание окрашивает коллаген и костную ткань в синий цвет. Дупликация скелета верхней челюсти отмечена стрелкой. На данном изображении представлена химера цыпленка и мыши, также окрашенная трихромным методом.

Наблюдается дупликация скелета верхней челюсти. На данном изображении представлен результат радиоактивной гибридизации in situ, демонстрирующий нормальную экспрессию BMP7 в мезенхиме эмбриона курицы; здесь показана ткань химеры мыши и курицы. Видно, что экспрессия BMP7 индуцирована в мезенхиме, прилегающей к трансплантату, что indicated стрелкой.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как манипулировать эмбрионами цыплят для изучения механизмов, регулирующих развитие лобного и носового отростков.