Ортотопическая Xenografting прав люциферазы-меткой Злокачественные клетки периферической нервной оболочки опухоли для В естественных условиях Тестирование кандидата терапевтических агентов

Метод для надежной прививкой люциферазы с метками человека злокачественных клеток периферической оболочки нерва опухолью в седалищный нерв иммунодефицитных мышей описана. Использование биолюминесценции отображения, чтобы убедиться в их исправности создание опухоли трансплантатов и критерии для случайных сегрегации животных в исследовательских группах, также обсуждаются.

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы определить, эффективно ли терапевтический препарат-кандидат подавляет рост M-P-N-S-T-клеток, привитых в седалищный нерв мышей с иммунодефицитом. Это достигается путем предварительного удаления опухолевых клеток из тканевой колбы, их промывки и суспензии в нужной концентрации. Вторым этапом процедуры является хирургическое обнажение седалищного нерва, а затем введение в него 5000 клеток.

Следующим шагом является определение успешности трансплантации с использованием in vivo световой визуализации, рандомизирующей CIN в исследуемые группы и начавшей терапию кандидатом в терапевтические средства. Заключительным этапом процедуры является сбор опухолей через 30 дней после трансплантации и анализ эффектов, которые потенциальный терапевтический агент оказал на опухоль. В конечном счете, могут быть получены результаты, которые показывают, уменьшал ли терапевтический агент рост опухоли с помощью таких методов, как сравнение веса опухоли, изучение относительных скоростей пролиферации с помощью иммуноокрашивания для KI 67 и оценка уровней гибели опухолевых клеток у контрольных и обработанных мышей с помощью туннельных анализов.

Основное преимущество этой методики перед существующими методами, такими как подкожная трансплантация, заключается в том, что она моделирует нормальное микроокружение, которое лучше моделирует рост M-P-N-S-T. Демонстрируя эту технику будет Эми Терк, техник из моей лаборатории. Необнаженных иммунодефицитных мышей готовят за день до прививки. Используйте машинку для стрижки, чтобы сбрить волосы от мыши, находящейся под наркозом, работая на грелке для поддержания температуры тела.

Используйте химическое средство для депиляции, чтобы удалить оставшиеся волосы. После того, как все волосы будут удалены, поместите мышь на грелку в изоляционную клетку без подстилки до полного восстановления. В день прививки центрифугируйте клетки при 3000 оборотах в минуту в течение пяти минут.

Осторожно удалите снат и повторно суспендируйте клеточную гранулу в DMEM 10 без чистого мицина до конечной концентрации пять умножить на 10 до трети клеток на три микролитра. Держите клетки на льду до тех пор, пока они не будут готовы к использованию. Для начала поместите животное под наркозом на грелку и нанесите офтальмологическую мазь на каждый глаз.

Прикрепите ушную бирку с уникальным идентификационным номером к правому уху каждой мыши. Для удобства идентификации на протяжении всего исследования положите животное на живот и разведите задние лапы. Накройте мышь стерильной простыней и откройте хирургическое окно, где будет происходить пересадка.

Нанесите бетадин на операционное поле с помощью аппликатора с ватным наконечником, начиная с центра боковой стороны и постепенно по спирали наружу к краям хирургического окна. Затем таким же образом на операционное поле наносится 70% этанол. Последовательное применение бетадина с последующим добавлением этанола повторяется еще дважды.

Извлеките клетки изо льда и либо осторожно сделайте вихрь, либо переверните трубку, чтобы снова суспензировать осевшие клетки. С помощью пипетки удалите 3,2 микролитра клеточной суспензии и выбросьте ее на кусочек параформы. Наберите три микролитра клеточной суспензии в 10-микролитровый шприц Hamilton.

Оснащен иглой 33 калибра. Держите ячейки и ячейку со шприцем на льду до тех пор, пока они не будут готовы к использованию. Используйте рукоятку скальпеля номер четыре, оснащенную лезвием скальпеля номер 22, чтобы сделать надрез через кожу бока чуть ниже и параллельно бедренной кости.

Откройте разрез кожи с помощью хирургического зажима, чтобы обнажить подлежащую мышцу. С помощью ножниц с острым концом рассеките фасцию, проходящую по всей длине ноги, и обнажите седалищный нерв, который лежит под белой линейной структурой толщиной примерно с толстую нить, работая под микроскопом. С помощью пары изогнутых щипцов с острым концом аккуратно рассеките под нервом, освободив его от подлежащей мышцы.

Оставьте щипцы на месте, чтобы нерв оставался как приподнятым, так и изолированным, осторожно введите иглу шприца Гамильтона в нерв, стараясь сохранить угол инъекции как можно более параллельным нерву, чтобы не проколоть нижнюю сторону. После того, как игла будет правильно расположена в нерве, ослабьте напряжение, создаваемое щипцами, и медленно вводите клетки в течение 45-60 секунд. Медленная инъекция необходима для предотвращения обратного потока опухолевых клеток, что приводит к их потере.

После того, как все клетки были успешно введены, медленно извлекайте иглу, чтобы свести к минимуму потери введенного материала. После завершения инъекции снимите хирургический зажим и щипцы. Затем осторожно верните нерв на исходное место.

Закройте разрез хирургическим клеем vet bond, удерживая его вместе щипцами примерно на 20 секунд, чтобы клей высох. Поместите животное в отапливаемую клетку без подстилки до тех пор, пока оно полностью не выздоровеет. Следите за здоровьем мышей.

Ежедневно мышей удаляют из исследования. Если опухолевая нагрузка превышает 10% от нормальной массы тела животного или потеря веса превышает 20%Чтобы определить успешность процедуры, проведите биолюминесцентную визуализацию через один и три дня после трансплантации. Введите в мышь 2,5 миллиграмма Люцифера и поместите животное под наркозом на нагретую платформу для визуализации.

Световое излучение от экспрессированной опухолью люциферазы светлячка обнаруживается через 10 минут после введения субстрата. С помощью программного обеспечения от Xeno Gen установите время получения изображения в диапазоне от одной секунды до 10 минут. Далее сделайте черно-белые фотографии мышей Pseudocolor.

Масштабирование биолюминесценции накладывается на эти изображения, чтобы обеспечить меру интенсивности светового излучения. Чтобы иметь право на включение в когорту доклинических испытаний, мыши должны иметь обнаруживаемый сигнал биолюминесценции как через один, так и через три дня после трансплантации, а интенсивность сигнала должна увеличиваться между первым и третьим днями. Здесь показано типичное прогрессирующее увеличение биолюминесценции, наблюдаемое через 1-18 дней после трансплантации у правильно установленного ортотопического ксенотрансплантата у голой мыши.

Обратите внимание на сходство сигналов, обнаруженных в пределах области интереса разных мышей. Повторная визуализация через 10 и 18 дней после трансплантации показывает, что биолюминесцентные сигналы постепенно увеличиваются в месте трансплантата у отдельных мышей. Количественная оценка биолюминесцентных сигналов, наблюдаемых через 1-24 дня после трансплантации, показывает, что, хотя эти сигналы постепенно увеличиваются, рост опухоли заметно ускоряется на более поздних стадиях периода исследования.

Учитывая агрессивный рост M pns ts, привитые опухолевые клетки часто нарушают нормальные барьеры нерва и проникают в соседние ткани. Эта микрофотография места трансплантата демонстрирует рост опухоли и очаговую инвазию в соседние скелетные мышцы После освоения этой техники ее можно выполнить на одной мыши за 10 минут при правильном выполнении.