Эффективное полиэтиленгликоля (ПЭГ) Опосредованное Преобразование Мосс Physcomitrella patens
19 апреля 2011 г.
Простой и эффективный метод для преобразования Physcomitrella pantens Протопластов описано. Этот метод адаптирован из протоколов Physocmitrella Protonemal протопластов и Arabidopsis Мезофильных протопластов преобразования 1.
Общая цель этой процедуры заключается в преобразовании метровых протопластов SCO. Это достигается путем предварительного переваривания растений с помощью Drizly. Затем протопласты промываются маннитолом для удаления дризли, а затем инкубируются с ДНК и ПЭГ.
Наконец, трансформированные протопласты распределяют по планшетам и инкубируют. В конечном итоге, результаты могут быть получены. Эти исследования показывают трансформированные протопласты, экспрессирующие флуоресцентно меченые белки с помощью флуоресцентной микроскопии.
Основное преимущество этой методики заключается в том, что она эффективна и стабильно генерирует протопласты, экспрессирующие интересующий белок Для выделения мха Протопласты начинают с добавления девяти миллилитров 8%-ного маннитола в чашку Петри с помощью шпателя Поместите пяти-семидневный мох от двух до трех PP NH четырех пластин в маннитол. Пожалуйста, ознакомьтесь с прилагаемым письменным протоколом для этого и дополнительных рецептов реагентов. Далее добавьте три миллилитра 2%дризли и выдерживайте при комнатной температуре с легким встряхиванием в течение часа.
Отфильтруйте смесь через ячейки 100 микрон для получения зеленой однородной суспензии. Затем вращайте фильтрат при 250 G в течение пяти минут. Выбросьте надосадочную жидкость очень аккуратно.
Ресуспендируйте протопласты в 500 микролитрах 8%-ного маннитола. Затем добавьте дополнительно 9,5 миллилитров 8%-ного маннитола. Убедитесь, что протопласты полностью подвешены.
Выполните шаги промывки еще два раза, снова вращая раствор при 250 G в течение пяти минут. Отбрасывание надосадочной жидкости и суспензия протопластов. Сначала в 500 микролитрах.
Затем 9,5 миллилитров 8%-ного маннитола с помощью гемоцитометра. Подсчитайте количество протопластов в 10 микролитрах суспензии, чтобы преобразовать ДНК в выделенные протопласты. Сначала крутите смесь протопластов при 250 G в течение пяти минут.
Удалите надосадочную жидкость, ресуспендируйте протопласты в дозе 1,6 млн на миллилитр в растворе ММГ. Выдерживают суспензию при комнатной температуре в течение 20 минут. Далее добавьте 600 микролитров раствора Протопластов в культуральную пробирку, содержащую 60 микрограммов ДНК. Трясти.
Аккуратно добавьте 700 микролитров раствора кальция ПЭГ и встряхните. Хорошо инкубируйте образец при комнатной температуре в течение 30 минут в течение этого периода ожидания. Накройте пластины PRMB целлофаном.
Затем разведите суспензию с тремя миллилитрами W пяти растворов, крутите при 250 G в течение пяти минут. Для удаления ПЭГ ресуспенд, протопласты в двух миллилитрах PRMT пластины по одному миллилитру на PRMB пластину покрыты целлофаном. Держите пластины при температуре 25 градусов Цельсия в камере роста.
Наконец, через четыре дня после преобразования, переместите целлофан на свежие тарелки для выбора. На этом рисунке показан пример 18-дневных растений, регенерированных из протопластов, преобразованных с помощью 15 микрограммов суперспиральной плазмы, ДНК, несущих кассету с устойчивостью к гигромицину. Здесь 30 микрограммов той же суперспиральной плазмиды, ДНК, были преобразованы в протопласты.
В этом образце было преобразовано 60 микрограммов ДНК пледа. И, наконец, эти растения были регенерированы из протопластов, которые были преобразованы с помощью 120 микрограммов той же суперспиральной плазменной ДНК, несущей кассету сопротивления гигромицину. На эффективность трансформации не влияют концентрации ДНК до 60 мкг.
Тем не менее, более высокие концентрации ДНК вредны для этой процедуры. Данные указывают на то, что этот метод дает стабильные результаты в широком диапазоне количеств ДНК один раз в семестр. Эту технику можно сделать за три часа, если она выполнена правильно.
После этой процедуры могут быть выполнены дополнительные методы, такие как транзиентная РНК-интерференция и нокаут генов, чтобы ответить на дополнительные вопросы о функции генов.
Обзор
В данной статье описывается простой и эффективный метод трансформации протопластов Physcomitrella patens. Методика адаптирована на основе существующих протоколов трансформации протопластов и направлена на получение стабильно успешных результатов.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Биология растений
- Генная инженерия
- Клеточная биология
Введение
- Протопласты — это растительные клетки, из которых удалены клеточные стенки.
- Методы трансформации имеют важное значение для изучения функций генов в растениях.
- Physcomitrella patens служит модельным организмом в исследованиях растений.
- Существующие методы трансформации протопластов могут быть сложными и трудоемкими.
Цель исследования
- Предоставить оптимизированный протокол трансформации протопластов Physcomitrella patens.
- Повысить эффективность и воспроизводимость трансформации протопластов.
- Обеспечить условия для дальнейших генетических исследований мха.
Используемые методы
- Переваривание тканей мха с помощью Drizly для выделения протопластов.
- Промывание протопластов маннитом для удаления загрязнений.
- Трансформация выделенных протопластов ДНК с использованием ПЭГ.
- Инкубация трансформированных протопластов на селективных средах.
Основные результаты
- Трансформированные протопласты успешно экспрессировали флуоресцентные белки.
- Метод продемонстрировал стабильную эффективность трансформации при различных концентрациях ДНК.
- Было установлено, что более высокие концентрации ДНК отрицательно сказываются на успехе трансформации.
- Вся процедура может быть выполнена примерно за три часа.
Выводы
- Данный метод представляет собой надежный подход к трансформации протопластов Physcomitrella patens.
- Он позволяет проводить последующие эксперименты, такие как транзиентная РНК-интерференция (RNAi) и нокаут генов.
- Этот протокол может существенно помочь в изучении функций генов мха.
Часто задаваемые вопросы
Промышленная значимость
ПЭГ-опосредованная трансформация протопластов Physcomitrella patens обеспечивает эффективную и воспроизводимую доставку генов, что способствует высокопроизводительному функциональному геномному анализу в растительных системах. Эта возможность крайне важна для исследовательских групп на ранних этапах поиска, стремящихся изучить функцию генов, подтвердить мишени и ускорить выяснение путей в генетически доступной модели. Масштабируемость и потенциал стандартизации данного метода делают его ценным инструментом для генетического скрининга всего портфеля проектов и снижения механистических рисков.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Обеспечивает быструю проверку функций генов за счет эффективной доставки ДНК в клетки мха.
- Поддерживает высокочастотный генный таргетинг для функциональной валидации мишеней и анализа путей.
- Способствует снижению механистических рисков, позволяя вносить точные генетические модификации в модельной системе.
- Повышает прогностическую уверенность в отношении последующих биологических гипотез.
Скрининг и разработка анализа
- Предоставляет стандартизированный протокол получения большого количества трансформантов для скрининговых анализов.
- Обеспечивает воспроизводимую эффективность трансформации, поддерживая надежность и масштабируемость анализа.
- Позволяет подготавливать валидированные биологические системы для оценки соединений и фенотипического скрининга.
- Снижает зависимость от специализированного оборудования, повышая доступность для групп по разработке методов анализа.
Трансляционные и доклинические исследования
- Обеспечивает возможность проведения последующих исследований, таких как переходная РНК-интерференция и изучение нокаута генов, имеющих значение для моделирования заболеваний.
- Поддерживает непрерывность процесса от открытия гена до доклинической валидации в растительных системах.
- Предоставляет платформу для поиска трансляционных биомаркеров при соответствии с путями, имеющими значение для развития заболевания.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный протокол трансформации применим на этапах от начального поиска до идентификации перспективных соединений, что позволяет осуществлять генетические манипуляции, валидацию мишеней и разработку методов анализа на модельных растениях.
- Открывающая биология: способствует проверке гипотез и уточнению сигнальных путей посредством эффективной доставки генов и анализа экспрессии.
- Скрининг: обеспечивает готовность и воспроизводимость анализов за счет создания однородных популяций трансформантов.
- Аналитика: предоставляет количественные данные, такие как эффективность трансформации и уровень экспрессии белка, для проведения сравнительного анализа.
- Трансляционные исследования: позволяют проводить генетические исследования, необходимые для разработки доклинических моделей и идентификации биомаркеров.
- Повторное использование в организации: предлагает широко применимый стандартизированный метод трансформации для различных генетических исследований.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: повышает прогностическую достоверность и снижает механистическую неопределенность в исследованиях функций генов.
- Операционная ценность: обеспечивает стандартизацию, воспроизводимость и масштабируемость рабочих процессов генетической трансформации.
- Стратегическая ценность: улучшает принятие решений о целесообразности дальнейшего развития (go/no-go) и эффективность использования капитала за счет обеспечения надежной генерации данных на ранних этапах.
- Влияние на портфель: поддерживает приоритезацию с учетом рисков и продвижение генетических мишеней и путей.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с культурами клеток растений и владение методами стерильного выделения и трансформации протопластов.
- Необходим доступ к базовой лабораторной инфраструктуре, включая центрифугирование и флуоресцентную микроскопию для валидации результатов.
- Требуется межкомандная стандартизация параметров трансформации для обеспечения воспроизводимости результатов в различных проектах.
- Может потребоваться адаптация метода для использования с другими видами растений или модельными системами, помимо Physcomitrella patens.
- Эффективность трансформации зависит от концентрации ДНК, при этом избыточное количество может оказать негативное влияние.
