NanoDrop микрообъеме Количественное определение нуклеиновых кислот

Система удержания образцов NanoDrop представляет собой инновационную технологию, использующую естественное поверхностное натяжение жидкостей для удержания и измерения микрообъемных образцов между двумя оптическими пьедесталами без использования кварцевых кювет или капилляров. Всего один микролитр образца дозируется непосредственно на нижнюю оптическую поверхность. При закрытии рычага спектрометра между верхним и нижним оптическими пьедесталами образуется жидкостный столбик.

За счет поверхностного натяжения формируется вертикальный оптический путь, длина которого может автоматически изменяться в режиме реального времени во время измерения. Сокращение длины пути позволяет измерять более высокие концентрации, что эффективно избавляет от необходимости проведения разведений для большинства образцов нуклеиновых кислот. Кроме того, система удержания образца ускоряет процесс проведения эксперимента благодаря быстрой очистке, которая заключается в простом протирании оптических поверхностей лабораторной салфеткой.

Сегодня мы продемонстрируем две процедуры определения концентрации нуклеиновых кислот с использованием микрообъемного оборудования Thermo Scientific. Первый протокол представляет собой прямое измерение нуклеиновых кислот с помощью спектрофотометра NanoDrop 2000 C. Второй протокол — косвенное флуоресцентное измерение нуклеиновых кислот с использованием флуороспектрометра NanoDrop 3000.

Для начала очистите верхнюю и нижнюю оптические поверхности системы удержания образца микрообъемного спектрофотометра, пипетировав от 2 до 3 µL чистой деионизированной воды на нижнюю оптическую поверхность. Опустите рычаг, чтобы верхний пьедестал вступил в контакт с деионизированной водой. Поднимите рычаг и протрите обе оптические поверхности чистой сухой безворсовой лабораторной салфеткой.

Затем откройте программное обеспечение NanoDrop и выберите приложение для анализа нуклеиновых кислот. С помощью калиброванного дозатора малого объема проведите измерение холостой пробы, нанеся один микролит буфера на нижнюю оптическую поверхность. Опустите рычаг и выберите функцию «blank» (холостая проба) в приложении для анализа нуклеиновых кислот.

После завершения измерения холостой пробы очистите обе оптические поверхности лабораторной салфеткой. Как и прежде, выберите соответствующую константу для образца, который необходимо измерить. Затем нанесите 1 µL образца нуклеиновой кислоты на нижний оптический пьедестал и опустите рычаг.

Поскольку измерение не зависит от объема, образец должен лишь заполнять пространство между двумя оптическими поверхностями. Для проведения измерения выберите команду measure (измерить) в программном обеспечении; программа автоматически рассчитает концентрацию нуклеиновых кислот и коэффициенты чистоты. После измерения образца ознакомьтесь со спектральными данными. Типичный образец нуклеиновой кислоты будет иметь очень характерный профиль.

Спектральные признаки образца плохого качества включают провалы длины волны в области минимума и в пике 260 нанометров. Распространенными источниками загрязнений, связанных с конкретными методами выделения нуклеиновых кислот, являются фенол, триэнол и колоночная экстракция. В случае фенол-хлороформной экстракции остаточное загрязнение реагентами может проявляться в виде аномальных спектров в диапазоне от 220 до 240 нанометров, а также в виде сдвигов в области от 260 до 280 нанометров.

Напротив, остатки гуанидина после экстракции из колонки могут вызвать появление пика в районе 230 нанометров и смещение минимума спектра с 230 нанометров примерно до 240 нанометров. Для точной оценки чистоты образца следует анализировать соотношения 2 62 80 и 2 62 30 в сочетании с общим качеством спектра. Чистые нуклеиновые кислоты обычно дают соотношение 2 62 80 примерно 1,8 для ДНК и примерно 2,0 для РНК соответственно.

Это соотношение зависит от pH и ионной силы буфера, используемого для контрольных и основных измерений. Флуоресцентный спектрометр Banana drop 3, 300 использует ту же запатентованную систему удержания микрообъемов образца, что и спектрофотометр NanoDrop 2000 C. Поскольку измерения флуоресценции проводятся с использованием всего одного микролитра образца, пользователь выбирает один из трех светодиодов в качестве источника возбуждения, который облучает образец горизонтально.

Затем последующая флуоресценция образца собирается под углом 90 градусов по вертикали во внутренний спектрометр. Для демонстрации высокой чувствительности количественного определения нуклеиновых кислот в микрообъемах с помощью NanoDrop 3 используется набор для флуоресцентного анализа PicoGreen; для начала необходимо довести стандарты набора и все образцы нуклеиновых кислот до комнатной температуры. Флуоресцентные образцы чувствительны к свету, поэтому их следует хранить в янтарных пробирках или пробирках, обернутых алюминиевой фольгой.

Приготовьте достаточное количество 1X буфера XTE для всех стандартов и образцов, подлежащих измерению, а также для приготовления необходимого рабочего раствора PicoGreen. Приготовьте 1X буфер XTE путем разведения предоставленного 20X буфера XTE водой, свободной от нуклеаз, согласно протоколу производителя. Объемы реакционной смеси могут составлять от 200 µL до 10 µL.

В данном примере мы подготовим реакционные смеси объемом 10 µL. Затем приготовьте серийные разведения стандартов двухцепочечной ДНК, а также стерильные пробирки или флаконы, не содержащие нуклеаз. Это позволит охватить ожидаемый диапазон концентраций в неизвестных образцах ДНК.

Перенесите по 5 µL каждого разведенного стандарта двухцепочечной ДНК в отдельные промаркированные безнуклеазные янтарные пробирки или пробирки, обернутые фольгой. Затем внесите по 5 µL каждого исследуемого образца двухцепочечной ДНК в соответствующие защищенные от света пробирки. После приготовления рабочего раствора Pico Green согласно протоколу производителя перенесите равный объем раствора (в данном случае 5 µL) в каждую пробирку, содержащую стандарт или образец двухцепочечной ДНК.

Смешайте равные объемы буфера XTE и рабочего раствора Pico Green. Для подготовки отрицательного контроля, который служит в качестве эталонного раствора, тщательно перемешайте содержимое каждой пробирки путем осторожного пипетирования и инкубируйте при комнатной температуре в течение пяти минут.

Все стандарты и образцы перед измерением следует довести до одной и той же температуры, так как температура влияет на интенсивность флуоресцентного сигнала. Для подготовки прибора и проведения предварительных измерений сначала очистите нижнюю и верхнюю поверхности системы удержания образца, затем нанесите две-три µL деионизированной воды на нижнюю оптическую поверхность. После этого откройте рычаг и протрите верхний и нижний пьедесталы чистой безворсовой лабораторной салфеткой.

Перед началом работы убедитесь, что на поверхностях нет ворсинок, так как они могут проявлять флуоресценцию при воздействии источника возбуждения и создавать помехи при измерении. Запустите программное обеспечение прибора.

Выберите приложение для анализа нуклеиновых кислот и выберите опцию pico green для двухцепочечной ДНК; перенесите 2 µL 1X TE на нижний пьедестал. Опустите рычаг и выберите «blank» (холостая проба) в соответствующем поле программного обеспечения прибора. После завершения измерения холостой пробы удалите остатки раствора с обеих поверхностей системы удерживания образца с помощью фильтровальной бумаги.

Затем осторожно перемешайте стандартный раствор, используя наконечники с низким уровнем удерживания. Нанесите 2 µL стандартного раствора на нижний пьедестал и опустите рычаг. Перейдите на вкладку «Standards», выберите «Reference» и установите необходимые единицы измерения.

Нажмите кнопку measure, чтобы запустить цикл измерения. По завершении цикла измерения откройте рычаг и тщательно промокните поверхности системы удержания образца. Измерьте до пяти повторностей референса, используя новый Eloqua для каждой повторности.

Повторите этот процесс для дополнительных стандартов, чтобы построить калибровочную кривую. Можно использовать до семи стандартов. Программное обеспечение позволяет сохранять до пяти повторностей для каждого стандарта.

Результаты повторов стандартов усредняются для построения градуировочного графика, на основании которого автоматически определяются концентрации образцов. После построения градуировочного графика перейдите на вкладку «образцы» (samples), введите соответствующую идентификационную информацию для каждого образца и измерьте каждый неизвестный образец. Построение достоверной кривой указывает на то, что минимальное количество стандартов было соблюдено.

Концентрация ДНК рассчитывается автоматически на основе стандартной кривой. Приборы NanoDrop для микрообъемов позволяют определять концентрацию нуклеиновых кислот как с помощью прямых измерений A₂₆₀, так и с помощью непрямых флуориметрических методов. Спектрофотометры NanoDrop также могут быть использованы для количественного определения белков с помощью прямого измерения абсорбции A₂₈₀ или с использованием колориметрических методов анализа белков.