FISH для подготовки к имплантации генетическая диагностика

В этой статье описывается выбор подходящих зондов для одноклеточных FISH, распространение методов бластомеров ядер, и в гибридизация и сигнал скоринга, применительно к предимплантационной генетической диагностики (ПГД) в клинических условиях.

Целью данной процедуры является использование метода флуоресцентной гибридизации in situ two для определения половой хромосомы или транслокационного статуса эмбрионов человека in vitro, подверженных риску генетических аномалий. Это достигается путем лизинга, биопсии одной клетки из эмбриона третьего дня на предметное стекло и сушки ядра на воздухе. Второй шаг заключается в кодировании D-природы и гибридизации ДНК ядра-мишени с ДНК-зондами, меченными флуорохромами разных цветов.

Затем избыток зонда удаляется с помощью строгой промывки, а ядро окрашивается флуоресцентным красителем, специфичным для ДНК. Заключительным этапом является осмотр ядра с помощью флуоресцентного микроскопа и получение цифровых изображений. В конечном счете, можно получить результаты, показывающие число копий целевых участков хромосомы с помощью флуоресцентной микроскопии.

Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, будут испытывать трудности, потому что он находится на самом пределе метода флуоресцентной гибридизации in situ. За 24 часа до этого подготовьте буфер для лизиса клеток для распространения клеток. Отфильтруйте раствор и раздайте один миллилитр аликвот в стерильные микроцентрифуги объемом от 10 до 15, 1,7 миллилитров, закройте и пробирки пробирки пробирки промаркируйте перед замораживанием при температуре минус 20 градусов Цельсия непосредственно перед процедурой биопсии.

Разморозьте буфер для лизиса при комнатной температуре. Забейте небольшой круг диаметром около пяти миллиметров на нижней стороне предметного стекла с аминовым покрытием с помощью алмазного пера, а затем с помощью твердого карандаша с четырьмя буквами H предварительно пометьте предметное стекло BLO латексной перчаткой. Чтобы удалить графитовую пыль, используйте отдельное затворное стекло для каждого зеркала бластера в числовом порядке.

Теперь поместите небольшой объем буфера для лизиса внутрь круга. Перенесите бластер для биопсии в буфер для лизиса. При необходимости добавляйте буфер для лизиса для лизиса клетки.

Наблюдайте за ядром, чтобы убедиться, что оно остается внутри круга и не теряется. Если клетка не имеет ядра или имеет несколько ядер, проведите биопсию другой клетки. Дайте предметному стеклу высохнуть на воздухе при комнатной температуре.

Сначала предварительно промойте образцы в банках коплана с использованием фосфатного буферного раствора в течение пяти минут при комнатной температуре. Затем дважды промыть в стерильной дистиллированной воде, обезвожить этаноловым рядом в течение двух минут каждый при комнатной температуре и высушить на воздухе. Убедитесь, что предметные стекла полностью погружены, и если графитовая пыль всплывает на поверхность, пропитайте их чистой салфеткой.

Запишите положение ядра в круге, визуализировав его с помощью фазово-контрастного микроскопа. Затем обезвожьте образцы 100% этанолом в течение двух минут при комнатной температуре и высушите на воздухе. Теперь нанесите два микролитра зондовой смеси и накройте крышкой размером девять на девять миллиметров.

Края покровного стекла заклеить резиновым цементом. Выполните закодированное натурирование. Наденьте нагревательный блок при температуре 75 градусов Цельсия на пять минут, а затем гибридизируйте в течение ночи в увлажненной камере при температуре 37 градусов Цельсия для каждой соединительной банки.

Уравновесьте 50 миллилитров 0,4-кратного раствора для стирки SSC в водяной бане 71 градус Цельсия. Поместите бутылку для строгой стирки и пустую банку для смешивания на водяную баню при комнатной температуре, нагрейте до 71 градуса Цельсия, pH, строгую стирку и разлейте по банкам для кохинхинов. Продолжайте осторожно удалять резиновый цемент с каждого предметного стекла и смывайте защитное стекло, используя четыре раза SSC 0,05% tween 20 pH семь при комнатной температуре.

Промойте образцы при строгой промывке при температуре 71 градус Цельсия при 0,4 раза SSC в течение пяти минут, а затем в четырех случаях при 0,05% SSC 20 при комнатной температуре в течение двух минут. Для зондов, которые имеют косвенную метку, слейте из предметных стекол лишнюю жидкость и нанесите 20 микролитров флуоресцентно конъюгированного антитела под квадрат параформы размером 20 на 20 миллиметров. Инкубировать во влажной камере при температуре 37 градусов Цельсия в течение 15 минут.

Снимите пара-пленку и выполните следующие стирки при комнатной температуре в течение двух минут. Один раз в четыре раза SSC 0,05% в 20 и два раза по две минуты в PBS. После слива стекла нанесите шесть микролитров монтажной среды для векторного экрана, содержащей DPI, с разрешением 22 на 22 миллиметра.

Пронумеруйте нулевое скольжение крышки и переверните ползунок над крышкой. Промокните слип и заклейте края чехла прозрачным лаком для ногтей. Наконец, проанализируйте образцы с помощью флуоресцентной микроскопии.

Оцените каждое ядро двумя независимыми аналитиками. Кроме того, используйте программное обеспечение для визуализации для получения изображения ядра для подтверждения визуального диагноза и архивирования изображений в рамках лабораторного контроля качества. Здесь метафазный разброс и интерфазное ядро, полученное из лимфоцитов периферической крови, указывают на носителя реципрокной транслокации между короткими плечами хромосом 5 и 9 с точками разрыва на пяти P 14,3 и девяти P two, 4,1.

Зонды Fish освещают как транс-локализованные сегменты, так и центральный сегмент сигналов девятой хромосомы. В интерфейсе Blast Simple Nuclei с третьего дня эмбрионы могут быть захвачены, а затем объединены для формирования составного изображения. Два сигнала для каждого зонда указывают на две копии каждого локуса, что согласуется с нормальным или сбалансированным комплементом.

Для транслокационных хромосом цветные сигналы указывают на одну копию транслокализованного сегмента хромосомы: пять, три копии транслокализованного сегмента девятой хромосомы и две копии центрического сегмента CH хромосомы девятой. Эти данные согласуются с несбалансированным произведением человека соми для пяти P 14,3 на пять PT и трисомии для девяти P два, от 4,1 до 9 pt. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как анализировать биопсию одной клетки, взятой из человеческого эмбриона, и получать одно ядро с помощью метода флуоресцентной гибридизации in situ.

Это важно для достижения воспроизводимых и оптимальных результатов теста для определения комплемента половых хромосом или транслокационного статуса эмбриона.