Клоногенных Пробирной: прилипшие клетки

Здравствуйте, меня зовут Лум, и в настоящее время я работаю над докторской диссертацией в Институте сердца и диабета BE IDI под руководством доктора Тома Карианна, который возглавляет лабораторию эпигеномной медицины. В этом видео я продемонстрирую процедуру, известную как анализ выживаемости с помощью клон-генов. Это 50-летняя методика, которая позволяет оценить влияние различных методов лечения, таких как воздействие радиации или химических агентов, на репродуктивную жизнеспособность клеток.

Конгенный анализ выживаемости является центральным методом в радиационной биологии для оценки радиационной чувствительности различных клеточных линий и проверки эффективности различных радиопротекторных или радиосенсибилизирующих соединений. При использовании адгезивной клеточной линии А криогенный анализ выживаемости состоит из трех фаз. Во-первых, лечение монослоя адгезивными клетками.

Во-вторых, приготовление суспензии одиночных клеток и покрытие известного числа клеток и окрашенных посуд, и, в-третьих, окрашивание, подсчет и колонии, образовавшиеся после периода инкубации. В этом видео я буду использовать увековеченные человеческие цино-сайты, чтобы продемонстрировать, как полигенный анализ Библии может быть использован для определения радиозащитных свойств природного антиоксиданта. 1225 М фла предварительно засеваются из клеток в 5 мил среды, так что в день эксперимента в колбе насчитывается 1 миллион клеток.

Для достижения требуемой концентрации добавляют 50 микролитров препарата в различных концентрациях к пяти милам среды в каждой надлежащим образом маркированной колбе, используют пять концентраций, а также один контрольный автомобиль, в данном случае PBS. После добавления препарата клетки инкубируют в течение одного часа в условиях, соответствующих используемой клеточной линии. Флюс, исключая контрольную группу, облучают в выбранной дозировке, которая в данном случае составляет четыре грей, производимых источником цезия, излучающим гамма-излучение.

После облучения среды сливаются и каждая колба промывается двумя милами PBS в течение пяти минут. После выливания PBS в каждую колбу добавляют два мила 0,05% трипсина, чтобы отделить адгезивные клетки А от колбы. Затем в каждую колбу добавляют нижние пять миллилитров DMEM, содержащих 10% фетальной бычьей сыворотки, чтобы деактивировать трипсин.

Затем полное содержимое fasc переносится в промаркированные 10-миллилитровые пробирки для сокола. После завершения эти пробирки центрифугируются в течение пяти минут, после чего супинатор осторожно выбрасывают, не нарушая нёба, и в каждую пробирку добавляют пять мил кремовой среды. Концентрация клеток для каждого образца рассчитывается ENC, а также объем, необходимый для достижения конечной концентрации клеток, которые должны быть выложены в пять чашек Петри на образец с пятью миллилитрами среды в каждой.

Например, для контрольной группы на чашку наносится 100 клеток, поэтому объем, необходимый для достижения 500 клеток на 25 миллилитров, рассчитывается для более концентрированных образцов, выполняющих либо 10-кратное разведение, либо 100-кратное серийное разбавление, чтобы свести к минимуму погрешность, возникающую при использовании объемов менее 100 микролитров. Теперь рассчитанный ранее объем готовится в пробирку Falcon, содержащую 25 миллилитров среды для каждого образца. Теперь образцы можно переносить в предварительно промаркированные формы для приготовления пищи, добавляя по пять миллилитров в каждую посуду для удобства обработки и транспортировки.

Храните посуду в большой, стерильной или продезинфицированной таре. Затем чашки помещают во увлажненный инкубатор в соответствующие условия и выдерживают в течение восьми дней. При использовании кератиноцитов через восемь дней осторожно выньте посуду из инкубатора и разложите их все одну за другой внутри вытяжного шкафа.

Будьте осторожны и обращайтесь с этим местом осторожно, чтобы не потревожить образовавшиеся колонии. Снимите крышки и добавьте пять мл 0,9% физиологического раствора в каждую посуду, чтобы вымыть ее. Направьте наконечник для приготовления в угол блюда и не касайтесь дна блюда, чтобы случайно не соскоблить колонии.

Через пять минут осторожно отсасывайте солевой раствор. Теперь колонии фиксируются тремя миллилитрами 4%-ной формулы, а провода необходимо заменить, чтобы избежать испарения. Через 15 минут или получаса смесь отсасывают и утилизируют соответствующим образом.

Теперь колонии готовы к окрашиванию 0,1% кристаллической фиалки, в каждое блюдо добавляют пять миллилитров, а крышки заменяют через полчаса-час. Затем краситель смывают дистиллированной водой, переворачивают посуду и дают ей высохнуть в течение ночи. Теперь колонии готовы к подсчету.

Колонии можно подсчитать вручную с помощью препарирующего микроскопа. Любое скопление клеток, содержащее 50 и более клеток, считается колонией. На этом мы завершаем нашу демонстрацию конгенического анализа выживаемости.

Основное преимущество этого анализа перед другими методами заключается в том, что он невероятно чувствителен и может обнаруживать выживание в большом диапазоне даже после шести логарифмов уничтожения клеток. Эта чувствительность достигается за счет нанесения большего количества клеток. Это эссе можно легко использовать для других целей, таких как тестирование, например, тестирование цитотоксичности.

Спасибо за просмотр.