Одной частицы электронной микроскопии Реконструкция комплекса Exosome Использование случайных Коническая Метод Tilt

Общая цель следующего эксперимента — получение трехмерной структуры экзосомного комплекса с использованием метода случайного конического наклона. Для этого сначала на медную сетку с отверстиями наносится тонкий слой углеродной пленки, которая служит поддерживающей подложкой для белкового комплекса, а на втором этапе наносится краситель. Образец и краситель наносятся на сетку, в результате чего образец обволакивается солями тяжелых металлов.

Затем проводится электронная микроскопия для получения пар микрофотографий образца при различных углах наклона. В итоге, на основании анализа изображений с использованием метода случайного конического наклона, определяют трехмерную структуру экзосомного комплекса. Как правило, специалисты, впервые применяющие данный метод, могут столкнуться с трудностями, так как качественная подготовка образца для метода случайного конического наклона, равно как и последующая процедура обработки изображений, зачастую оказываются сложными задачами.

Демонстрация этого метода имеет критическое значение, так как этапы определения качества и подготовки образцов трудно освоить без иллюстрации процесса оценки проб. Принцип метода случайного конического наклона требует получения пары микрофотографий одного и того же участка образца внутри электронного микроскопа. Один снимок делается при отсутствии наклона образца, а второй — при наклоне под углом от 50 до 70 градусов. С помощью компьютера оцифрованная пара микрофотографий располагается рядом, после чего в данной иллюстрации выбираются изображения одних и тех же частиц.

Эти изображения промаркированы номерами в трехмерных координатах. Изображения ненаклоненных частиц и соответствующих им наклоненных партнеров коррелируют друг с другом по направлению оси наклона и углу наклона. Выравнивание изображений ненаклоненных частиц приводит изображения наклоненных частиц в их соответствующие положения asMule; используя несколько изображений наклоненных частиц, заполняющих азимутальное пространство, можно реконструировать трехмерную структуру молекулы с помощью алгоритма обратной проекции. Для изготовления сеток сначала приготовьте 0,5% раствор Formvar, добавив 0,45 г поливинилформальдегидной смолы и 90 мл хлороформа в стеклянный стакан объемом 100 мл.

В вытяжном шкафу накройте стакан алюминиевой фольгой и растворите смолу Formvar. При использовании маленького магнитного якоря и магнитного перемешивания растворение смолы занимает около 15 минут. Тем временем очистите предварительно промытые предметные стекла для микроскопии метанолом с помощью салфеток Kim wipes.

После полного растворения смолы Formvar в хлороформе добавьте на поверхность раствора один миллилитр 50% глицерина. Регулируя объем добавляемого глицерина, можно изменять плотность отверстий в перфорированном углероде.

Опустите наконечник ультразвукового гомогенизатора в раствор. На глубине примерно one inch используйте максимальную мощность для соникации в течение одной минуты, чтобы создать эмульсию из капель глицерина в нашем растворе. Более длительная соникация приведет к уменьшению размера отверстий в перфорированном углероде.

После этого этапа раствор становится мутным. Сразу после погружения в ультразвуковую ванну стеклянные предметные стекла погружаются в эмульсию вертикально. Спустя одну секунду извлеките их и промокните нижнюю часть стекол фильтровальной бумагой, чтобы на их поверхности образовалась тонкая пластиковая пленка.

После испарения хлороформа проверьте плотность и размер отверстий в пленке с помощью светового микроскопа. Описанные здесь условия подготовки должны обеспечить появление от 10 до 20 отверстий в каждом квадрате сетки с размером ячейки 400 mesh, при этом диаметр отверстий должен составлять от трех до четырех микрометров. После высыхания предметных стекол обрежьте края пластиковой пленки на поверхности стекла.

Перенесите пленку на поверхность дистиллированной воды, вертикально погрузив предметное стекло в воду. Тонкую пленку на поверхности воды можно наблюдать под острым углом по отражению света. Поместите на пленку медные сетки с размером ячейки 400 mesh, одну за другой, гладкой стороной вниз.

С помощью листа бумаги поднимите пластиковую пленку с сеткой. Переверните бумагу и дайте ей высохнуть. Поместите бумагу в чашку Петри и замочите в метаноле, чтобы удалить остаточный глицерин из отверстий, затем высушите бумагу на воздухе.

Используйте углеродный испаритель, чтобы нанести на сетки слой углерода толщиной примерно 20 nanometers. Для достижения требуемой толщины регулируйте время испарения. Толщину можно определить по серому цвету углерода в сравнении с серым цветом слоя углерода известной толщины.

Замочите углеродные многослойные сетки в хлороформе в стеклянной чашке Петри на полчаса для удаления Formvar; последующее высушивание сеток позволяет получить самодельные «дырявые» углеродные сетки. Затем нанесите путем испарения тонкий слой углерода толщиной около 5 нм на свежесколотую поверхность слюды. После этого осторожно поместите «дырявые» углеродные сетки на кусочек фильтровальной бумаги под слой дистиллированной воды.

С помощью самодельного устройства перенесите тонкий слой углерода с поверхности слюды на поверхность воды, а затем медленно осадите его на дырчатые углеродные сетки. Извлеките фильтровальную бумагу с сетками и дайте ей высохнуть. В вытяжном шкафу начните негативное окрашивание экзосомного комплекса, приготовив свежий 2% раствор формиата уринила.

Как описано в письменной процедуре, оберните пробирку с раствором кусочком алюминиевой фольги. Для предотвращения воздействия света раствор необходимо использовать в тот же день. Обработайте одну тонкую углеродную подложку в аппарате для тлеющего разряда, полностью покрыв углеродную сетку. Затем положите на рабочий стол кусочек чистого парафина; с помощью пипетки нанесите три капли по 50 µL раствора красителя формата уринала на поверхность парафина. Разведите комплекс экзосом до концентрации примерно 50 nM, используя буфер для разведения. С помощью пипетки нанесите 4 µL разведенного белка на сетку, обработанную тлеющим разрядом.

Оставьте образец на сетке на одну минуту, затем удалите остатки раствора кусочком фильтровальной бумаги с помощью пинцета. Сразу же переверните сетку на первую каплю красителя и промойте ее, перемещая вперед и назад несколько раз в течение примерно 10 секунд. Повторите этот процесс для каждой из трех капель красителя; после последнего промывания оставьте краситель на сетке еще на одну минуту.

Затем удалите излишки красителя с помощью фильтровальной бумаги. Оставьте тонкий слой раствора красителя на поверхности сетки и дайте ей высохнуть в вытяжном шкафу. Поместите сетку с образцом в держатель, а затем установите держатель в электронный микроскоп FEI TE nine 12.

Просмотрите сетку с образцом при низком увеличении, чтобы найти наиболее качественно окрашенные квадраты. В подходящем квадрате должно быть около двенадцати отверстий размером примерно от one to two micrometers с темноокрашенными областями внутри них. Включите режим низкой дозы (low dose mode) в пользовательском интерфейсе FEI, затем настройте фокус поиска и положение экспозиции в режиме низкой дозы.

Переведите поиск в режим дробления с длиной камеры 1,5 метра. Установите фокус на увеличении 150 K и экспозицию на увеличении 50 K с временем выдержки одну секунду. Обычно для выполнения выравнивания используется узнаваемый объект на сетке, видимый как в режиме поиска, так и в режиме экспозиции.

В режиме поиска найдите отверстия с хорошим окрашиванием и сохраните их координаты. Сделайте ПЗС-снимок квадрата. Наклоните образец на 55 градусов и сделайте еще одно изображение.

Сравните два изображения и определите соответствующие друг другу отверстия на двух микрофотографиях. Верните столик в исходное положение (ноль градусов). Используя комплект для работы с низкой дозой облучения, сделайте снимки каждого отверстия, определенного в режиме поиска, при большом увеличении и дефокусировке около -0.7 µm.

После того как будут сделаны снимки всех отверстий, наклоните столбец под углом 55 градусов, используя то же увеличение. Снимите микрофотографии наклоненного образца с расфокусировкой около минус 1.2 micrometers. Определите соответствующую пару микрофотографий с наклоном, основываясь на паттернах на микрофотографиях с малым увеличением, используя неправильный рисунок самодельных перфорированных углеродных сеток.

Для обеспечения корректной корреляции выбирайте пары микрофотографий с разным наклоном, на которых частицы распределены равномерно и не имеют ореолов. Микрофотографии с явными ореолами красителя вокруг частиц следует исключить из обработки данных. Начните с настройки программы в разделе «Процедура».

Обработка изображений будет продемонстрирована с использованием процесса 2D в пакете Eman. Для изменения формата изображений используется пакет iMagic five для выполнения 2D-выравнивания и пакет spider. Для выполнения 3D-реконструкции и уточнения преобразуйте цифровое изображение Gatan DM3 в формат изображений spider.

С помощью команды process 2D выберите пары частиц. С помощью веб-программы, входящей в пакет программ spider, программа автоматически сохраняет координаты частиц и экспортирует все выбранные частицы с помощью скрипта spider. Скрипт сохраняет стеки наклонных и ненаклонных частиц.

Преобразуйте ненаклонные частицы из формата UN в формат IMAG five. Используя программу EM two EM, примените полосовой фильтр и маскирование для ненаклонных частиц с помощью команды InCorp prep в IMAG five, а затем центрируйте частицы с полосовой маской с помощью команды center. В IMAG five выполните итеративное выравнивание и классификацию частиц по гомогенным классам, используя пакетный скрипт для автоматического запуска программ IMAG five.

Затем используйте команду names in class в программе IMAG five для создания таблицы поиска классов частиц, а также команду header для создания файла графика со значениями трансляции и ротации выравнивания для каждой частицы. В iMagic five преобразуйте выровненные частицы в формат spider с помощью программы EM two EM. После этого преобразуйте таблицу поиска классов в файлы документов spider.

Значения трансляции и ротации выравнивания для каждой частицы также преобразуются в файл документа spider. Примените полосовой фильтр, маску и центрируйте наклоненные частицы точно так же, как и ненаклоненные частицы в IMAG five, и создайте новый набор данных для центрированных наклоненных частиц. Создайте файлы угловых документов на основе документов многореференсного выравнивания, созданных в IMAG five, и файлов DCB, созданных веб-программой. Используйте скрипт обратной проекции в spider для получения одной начальной модели для каждого усреднения по классу.

Наконец, выполните уточнение проекций исходного тома с помощью скрипта spider по всем частицам без наклона, чтобы получить окончательный том методом RCT. Было получено около 50 реконструкций экзосомы. Тома созданы на основе наклоненных частиц, соответствующих каждой частице в 50 классах частиц без наклона.

Используя метод обратной проекции, реализованный в пакете spider, было выполнено уточнение путем сопоставления проекций. Используя эти объемы в качестве исходных моделей, была создана представленная 3D-реконструкция экзосомы с разрешением около 18 Å; затем в 3D-карту можно было вписать атомные модели различных частей комплекса. После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать, как использовать RCT для получения трехмерных реконструкций: от подготовки качественной витрифицированной сетки с образцом и получения микрофотографий до итоговой реконструкции с помощью методов анализа изображений. Помимо описанного здесь протокола, в анализе изображений существует несколько других методов получения конечных реконструкций.

Наиболее важным этапом для получения достоверной и правильной реконструкции является работа с хорошо подготовленным образцом.