Одной частицы электронной микроскопии Реконструкция комплекса Exosome Использование случайных Коническая Метод Tilt

Общая цель данного эксперимента состоит в том, чтобы получить трехмерную структуру экзосомного комплекса с помощью метода случайного конического наклона. Это достигается путем нанесения тонкого слоя углеродной пленки на святую углеродную сетку, чтобы сделать опорную основу для белкового комплекса и морилки в качестве второго шага. Образец и морилка наносятся на сетку, которая погружает образец в соли тяжелых металлов.

Затем проводится электронная микроскопия для получения наклонных пар микрофотографий образца. Наконец, получены результаты, показывающие трехмерную структуру экзосомного комплекса на основе анализа изображений с использованием метода случайного конического наклона. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, испытывают трудности, потому что иногда бывает трудно подготовить образец к методу случайного конического наклона, а также выполнить процедуру обработки изображения, которая следует за View.

Демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как этапы подготовки сортов и образцов трудно изучить без иллюстрации оценки образца. Принцип метода случайного конического наклона заключается в том, чтобы сделать пару микрофотографий одной и той же области образца внутри электронного микроскопа. На одном снимке изображен образец в ненаклоненном положении, а на другом изображен образец, наклоненный под углом от 50 до 70 градусов

Эти изображения обозначены цифрами в трехмерных координатах. Изображения неопрокинутых частиц и их наклоненных партнеров коррелируют друг с другом направлением оси наклона и углом наклона. Выравнивание изображений ненаклоненных частиц приводит изображения наклоненных частиц к их соответствующим местоположениям в качестве aMule с использованием нескольких изображений наклоненных частиц, заполняющих азимутальное пространство, трехмерная структура молекулы может быть реконструирована с использованием алгоритма обратной проекции для изготовления сеток во-первых, получение 0,5% формы VAR путем добавления 0,45 грамма поливинилформальной смолы, и 90 миллилитров хлороформа на 100-миллилитровый стеклянный стакан

В вытяжном шкафу накройте стакан алюминиевой фольгой и растворите в форме вар-смолу. С помощью восьмерки небольшой полосы перемешивания и магнитного перемешивания смоле требуется около 15 минут, чтобы раствориться. Тем временем очистите предварительно очищенные предметные стекла для микроскопии в метаноле и салфетками Кима.

После формы вар смола полностью растворяется. В хлороформ добавьте один миллилитр 50%-ного глицерина на поверхность раствора. Регулировка объема добавляемого глицерина влияет на плотность отверстий в святом угле.

Опустите наконечник ультразвукового аппарата в раствор. На глубине около одного дюйма используйте максимальную мощность для ультразвуковой обработки в течение одной минуты, что приведет к образованию эмульсии из капель глицерина в виде нашего раствора. Более длительная ультразвук приведет к уменьшению размера отверстий в святом угле.

После этого раствор становится молочным. Сразу после погружения в ультразвук чистое стекло вертикально скользит в эмульсию. В течение одной секунды выньте их и промокните нижнюю часть предметных стекол фильтровальной бумагой, чтобы на поверхности предметных стекол образовалась тонкая пластиковая пленка.

После того как хлороформ испарится, проверьте плотность и размер отверстий в пленке под световым микроскопом. Описанное здесь условие подготовки должно производить от 10 до 20 отверстий в каждом квадрате сетки размером 400 ячеек диаметром от трех до четырех микрометров. Как только стеклянные предметные стекла высохнут, обрежьте край пластиковой пленки на поверхности предметного стекла.

Снимите пленку на поверхность дистиллированной воды, вертикально погрузив предметное стекло в воду. Тонкую пленку на поверхности воды можно наблюдать под скользящим углом против отражения света. Поместите медные сетки 400 меш на пленку, одну за другой гладкой поверхностью сетки вниз.

Поднимите полиэтиленовую пленку с нанесёнными на неё сетками с помощью листа бумаги. Переверните бумагу и дайте ей высохнуть. В чашке Петри смочите бумагу в метаноле, чтобы удалить остатки глицерина в отверстиях, и дайте бумаге высохнуть на воздухе.

Используйте угольный испаритель, чтобы покрыть решетки слоем углерода толщиной примерно 20 нанометров. Использование времени испарения для контроля нужной толщины. Толщина может быть определена по серому цвету углерода по сравнению с серым цветом известного толщины слоя углерода.

Замочите угольные слоистые сетки с хлороформом в стеклянной чашке Петри на полчаса, чтобы удалить форму вар формы и удалить вар, с последующим высыханием сеток получится самодельная святая карбоновая решетка. Затем испарите тонкий слой углерода толщиной около пяти нанометров на свежерасщепленную поверхность слюды. Затем осторожно положите священные угольные решетки на лист фильтровальной бумаги под дистиллированную воду.

В самодельном аппарате поместите тонкий углерод с поверхности слюды на поверхность воды и медленно отложите его на священные углеродные решетки. Возьмите в руки фильтровальную бумагу с нанесёнными на неё сетками и дайте ей высохнуть. В вытяжном шкафу начните негативное окрашивание экзосомного комплекса путем внесения свежего 2%-ного раствора формиата писсуара.

Как описано в письменном порядке действий, накройте тюбик раствора куском алюминиевой фольги Чтобы предотвратить попадание света, раствор нужно использовать так же. Дневной тлеющий разряд одним тонким углеродом над полностью углеродной сеткой с помощью тлеющего разрядного аппарата. Далее поместите кусочек чистого отдушки на скамейку пипетки три капли по 50 микролитров мочевого гриба раствора для окрашивания формиата сверху перфила, разведите экзосомный комплекс до концентрации примерно 50 наномоляров. С помощью разбавляющего буфера пипеткой внесите четыре микролитра разведенного белка до тех пор, пока свечение не разрядится из сетки.

Дайте образцу постоять на сетке в течение одной минуты, затем промокните остатки раствора листом фильтровальной бумаги с помощью пинцета. Переверните сетку сразу поверх первой капли пятна и промойте сетку, перемещая ее вперед-назад несколько раз в течение примерно 10 секунд. Повторите этот процесс для каждой из трех капель пятна после последнего полоскания, дайте пятну остаться на сетке еще на одну минуту.

Затем промокните пятно листом фильтровальной бумаги. Держите тонкий слой раствора морилки на поверхности сетки и дайте сетке высохнуть в вытяжном шкафу. Поместите сетку для образцов в держатель для образцов, а затем поместите держатель в электронный микроскоп FEI TE девять 12

Проверьте сетку образцов при малом увеличении, чтобы найти лучшие окрашенные квадраты. Хороший квадрат имеет дюжину отверстий размером около одного-двух микрометров и темные пятна в них. Включите режим низкой дозы в пользовательском интерфейсе FEI и совместите фокус поиска и положение экспонирования в режиме низкой дозы.

Установите режим поиска в дробный режим с длиной камеры 1,5 метра. Установите фокус на увеличение 150 K и установите увеличение экспозиции на 50 K с измеренным временем экспозиции в одну секунду. Как правило, для выполнения выравнивания используется узнаваемый объект на сетке как в режиме поиска, так и в режиме экспозиции.

Найдите отверстия с хорошим окрашиванием в режиме поиска и сохраните локации. Сделайте ПЗС-матрицу квадрата. Наклоните экземпляр на 55 градусов и сделайте еще один снимок.

Сравните две фотографии и определите парные отверстия на двух микрофотографиях. Наклоните сцену обратно до нуля градусов. С помощью набора с низкой дозой можно сделать снимки каждого обнаруженного отверстия в режиме поиска при большом увеличении с расфокусировкой около минус 0,7 микрометра.

отверстия будут сфотографированы, наклоните сцену на 55 градусов, используя то же увеличение. Сделайте микрофотографии наклоненного образца с расфокусировкой примерно минус 1,2 микрометра. Определите соответствующую пару микрофотографий с наклоном на основе шаблонов на микрофотографиях с малым увеличением, используя нерегулярный узор самодельных самодельных сеток из священного углерода.

Чтобы помочь корреляции, выберите пары наклона микроснимков с равномерным распределением частиц и без ореолов вокруг частиц. Те микрофотографии с явными ореолами пятен вокруг них должны быть отброшены для обработки данных. Начните с настройки программы В процедуре.

Обработка изображений будет продемонстрирована с помощью процесса 2D в пакете Eman. Для изменения формата изображения в пакете iMagic five необходимо выполнить 2D-выравнивание, а также в пакете пауков. Чтобы выполнить 3D-реконструкцию и уточнение, преобразуйте цифровое изображение DM three Gatan в формат spider

С помощью команды process 2D выберите пары частиц. Используя веб-программу, распространяемую в пакете программы-паука, программа автоматически сохраняет координаты частиц и отбрасывает все выбранные частицы с помощью скрипта паука. Скрипт сохраняет наклоненные и ненаклоненные стеки частиц.

Преобразуйте наклоненные частицы UN в формат IMAG five. Используя программу полосы пропускания EM two EM, отфильтруйте и замаскируйте наклоненные частицы UN с помощью команды InCorp prep в IMAG five и центрируйте замаскированные частицы через полосу пропускания с помощью команды center. В imag five выровняйте и классифицируйте частицы итеративно по однородным классам с помощью пакетного скрипта, автоматически выполняющего программы IMAG five.

Затем используйте команду MSA names in class в IMAG 5 для создания таблицы поиска частиц в классе, сгенерируйте файл графика для трансляции и поверните значения выравнивания для каждой частицы с помощью команды header. В iMagic five можно преобразовать выровненные частицы в формат паука с помощью программы EM two EM. Затем измените таблицу поиска классов на файлы документов-пауков.

Значения смещения и поворота выравнивания для каждой частицы также преобразуются в фильтр полосы пропускания файла документа-паука, маскируют и центрируют наклоненные частицы так же, как для ненаклоненных частиц в IMAG 5, генерируют новый набор данных для частиц с наклоном в центре. Создавайте файлы документов Angular из документов выравнивания с несколькими ссылками, сгенерированных IMAG 5, и файлов DCB, созданных веб-программой. Используйте скрипт обратной проекции в пауке, чтобы получить по одной исходной модели для каждого среднего класса.

Наконец, выполните проекционное уточнение начального объема с помощью скрипта-паука на все ненаклоненные частицы, чтобы получить окончательный объем с помощью РКИ. Было получено около 50 реконструкций экзосомы. Объемы генерируются из наклоненных частиц, соответствующих каждой частице в 50 классах ненаклоненных частиц.

Используя эти объемы в качестве исходных моделей, и отображаемый 3D-объем экзосомы был сгенерирован примерно на 18 анг с дополнительным разрешением, мы затем можем погрузиться в атомные модели различных частей комплекса на 3D-карте. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как использовать РКИ для получения трехмерных реконструкций от создания хорошей повествовательной сетки образцов до одноранговых микрофотографий и, наконец, до получения реконструкции с использованием методов анализа изображений. Помимо описанного нами протокола, существует несколько методов получения окончательных реконструкций при анализе изображений.

Самым ответственным этапом для получения достоверной правильной реконструкции является работа с хорошо подготовленным образцом.