Сосредоточены ионного пучка фрезерные и сканирующей электронной микроскопии ткани мозга

Целью данной процедуры является получение серии изображений определенной области ткани мозга с использованием фокусированного ионного пучка и сканирующего электронного микроскопа. Для этого сначала мозг разделяют на срезы, которые окрашивают и затем заливают смолой. На втором этапе из залитого смолой среза мозга вырезают область интереса и закрепляют ее на чистом смоляном блоке.

Третьим этапом является обрезка полимерного блока на ультрамикротоме и использование ионного пучка микроскопа для выделения только той области, которая подлежит визуализации. Заключительный этап представляет собой серийную визуализацию поверхности полимерного блока с использованием ионного пучка для многократного удаления тонких слоев перед каждым снимком. В итоге можно получить результаты, представляющие собой серию изображений через область интереса.

Серия изображений собирается автоматически, и набор данных обычно состоит из изотропных вокселей, что позволяет просматривать структуры изображения под любым углом в стеке. Основное преимущество этого метода перед существующими способами, такими как серийная трансмиссионная электронная микроскопия срезов, заключается в возможности достижения гораздо более высокого разрешения по оси Z. А по сравнению с электронной томографией он позволяет получать изображения значительно больших объемов с оптимальным разрешением для образцов, залитых смолой.

Процедура начинается с извлечения фиксированного мозга крысы, подвергнутой анестезии и перфузии. Поместите мозг в пластиковую форму с теплым 5% раствором агарозы, ориентируйте мозг под нужным углом до затвердевания агарозы, затем закрепите блок агарозы с мозгом на держателе для образцов вибротома. Вырежьте корональные срезы толщиной 80 мкм в количестве, достаточном для охвата интересующей области.

Затем поместите образцы в стеклянные изолирующие флаконы объемом 20 milliliter. Помещайте до 10 срезов в один флакон. Промойте образцы трижды по пять минут в 0.1 molar K coate буфере.

Затем окрасьте образцы 1.5% цианидом калия и 1% тетраоксидом осмия в 0.1 молярном какоатном буфере в течение 30 минут. Продолжите окрашивание образцов 1% тетраоксидом осмия в 0.1 молярном какоатном буфере в течение 30 минут. После этого один раз промойте образцы дважды дистиллированной водой в течение трех минут, затем окрасьте 1% ацетатом алюминия в дважды дистиллированной воде в течение 30 минут.

Затем промойте срезы в дважды дистиллированной воде в течение пяти минут, после чего проведите их обезвоживание в серии спиртов возрастающей концентрации, выдерживая срезы по две минуты при каждой смене раствора. Следующим этапом является заливка срезов в смолу Duran, смешанную со спиртом в различных пропорциях, с интервалом в 30 минут между сменами. Начните со смеси этанола и смолы в соотношении 50 к 50, затем переведите в соотношение 30 к 70, далее в 10 к 90 и, наконец, выдержите срезы в 100% смоле в течение 30 минут.

Затем замените среду на 100% свежую смолу Duran. Медленно перемешивайте в течение одного часа на ротационном миксере. После заливки с помощью деревянной зубочистки перенесите срезы на предметные стекла микроскопа, предварительно покрытые разделительными агентами для форм.

Разместите на предметных стеклах как можно больше срезов, стараясь при этом не перегружать их. Убедитесь, что между стеклами также помещена идентификационная метка. Поместите стекла в печь при температуре 65 °C на 24 часа.

На следующий день извлеките образцы из печи. Осторожно проведите лезвием бритвы между стеклами предметных микроскопов и, придерживая пальцами, извлеките слой смолы с образцами из пространства между стеклами. Аккуратно промойте образец под проточной водой.

Для удаления остатков разделительных агентов для форм поместите образец под стереомикроскоп с проходящим освещением, используя объектив с малым увеличением. Отметьте интересующую область тонкой иглой. С помощью лезвия бритвы вырежьте небольшой квадрат размером 3 мм на 3 мм вокруг интересующей области.

С помощью акрилового клея прикрепите небольшой блок смолы к верхней части чистого блока смолы. Затем зажмите блок в держателе ультрамикротома. Используя прикрепленный стереомикроскоп, обрежьте материал вокруг интересующей области с помощью лезвия бритвы до тех пор, пока не останется небольшой фрагмент в форме пирамиды.

Отрежьте край блока рядом с областью интереса под углом к верхней поверхности блока, используя стеклянный нож, закрепленный в ультрамикротоме. Продолжите обрезку блока таким образом, чтобы область интереса можно было точно локализовать относительно размеров поверхности блока. Извлеките блок из ультрамикротома и поместите его под просвечивающий световой микроскоп.

Сфотографируйте область интереса. С помощью ювелирной пилы отделите обрезанный блок от оставшегося смоляного основания с углеродной краской. Закрепите отделенный блок SA на держателе образцов СЭМ и ориентируйте его так, чтобы сторона, предназначенная для визуализации, была обращена к внешнему краю.

После высыхания клея перенесите препарат в систему напыления и вакуумного испарения, затем покройте блок тонким слоем золота толщиной более 20 nanometers. Теперь блок ткани, залитый в смолу, готов к визуализации с помощью сканирующего электронного микроскопа с фокусированным ионным пучком. Поместите образец в держателе в микроскоп при малом увеличении и, используя режим детектирования вторичных электронов, ориентируйте блок таким образом, чтобы интересующая область и сторона блока, предназначенная для визуализации, были обращены к детектору.

Оператор ориентирует блок таким образом, чтобы поверхность, которую необходимо визуализировать, располагалась параллельно фрезерующему пучку. В результате электронный пучок ориентируется под углом 54 градуса к этой поверхности при использовании тока ионного пучка от 13 до 27 nano amps и напряжении 30 kilovolts.

Удалите узкую полоску смолы с передней части области, предназначенной для визуализации. Затем переключитесь в режим изображения обратнорассеянных электронов, чтобы увидеть фрезерованную поверхность, перекрывающую область интереса. Используя ранее полученное референсное изображение, сделанное с помощью светового микроскопа, и изображение фрезерованной поверхности, точно определите на блоке область, которую необходимо фрезеровать и визуализировать, используя систему газового впрыска микроскопа.

Нанесите на поверхность блока над областью интереса защитный слой углерода или металла толщиной около одного микрона, используя ток 700 picoamps. В завершение выполните фрезерование той области блока, в которой будут получены итоговые изображения. Продолжайте фрезерование поверхности изображения до полного исчезновения артефактов фрезерования на этой поверхности.

Выберите параметры микроскопа для серийной съемки поверхности. Типичные параметры: напряжение от 1.2 до 2 кВ и размер пикселя от 4 до 20 нм. Время dwell-сканирования пикселя должно составлять около 10 мкс, чтобы общее время обработки поверхности и получения одного изображения составляло менее двух минут.

Дайте микроскопу отстояться в течение не менее двух часов для стабилизации температуры. После этого запустите процесс фрезерования и визуализации для получения серии изображений интересующей области. На данном рисунке представлено инвертированное изображение обратнорассеянных электронов поверхности блока, демонстрирующее ультраструктуру области мозга обертона.

Все мембраны, а также крупные макромолекулярные структуры хорошо видны. Данный рисунок представляет собой совокупность 1 600 изображений, полученных с шагом в 5 нм, что позволило сформировать стек изображений с изотропными вокселями. Этот стек можно визуализировать в любой плоскости с одинаковым разрешением.

Таким образом, после просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как подготовить ткани мозга для серийной визуализации с помощью фокусирующего ионного пучка сканирующего электронного микроскопа.