Структурирование Ячейки оптически прозрачные электроды индия оксид олова

Привет, меня зовут Иша. Я учусь на втором курсе аспирантуры в лаборатории доктора Дзен. Мы находимся на факультете биомедицинской инженерии Калифорнийского университета в Дэвисе.

Сегодня я собираюсь показать вам управление Яном на микро оптически прозрачных электродах из оксида индия 10 в тканевой инженерии, и были предприняты усилия по регенерации, чтобы имитировать микроокружение органа. Чтобы создать такое микроокружение in vitro, необходимо пространственно и временно изолировать клетки на субстрате. Мы заинтересованы в проектировании поверхностей, на которых мы можем контролировать расположение различных типов клеток печени.

В сегодняшнем эксперименте мы будем использовать модификацию поверхности, микропроизводство и электрохимию для формирования поверхности, которая может быть заменена с неадгезивной на клеточную адгезивную. Первым этапом является фотолитография. Вот блок-схема того, как будет работать этот процесс.

Синий — это стеклянный свет, зеленый — оксид индия-10, который покрыт поверх стеклянного фонаря. Во-первых, что мы собираемся сделать, это отжимать фоторезист красного цвета, показанный здесь, поверх стеклянного фонаря с покрытием из оксида индия 10. Затем мы пропустим его через фотошаблон к ультрафиолетовому свету, и экспонируемые области будут разработаны в проявочном растворе.

Области ITO, которые не защищены фоторезистом, будут удалены в IT oing. И, наконец, весь оставшийся фоторезист будет удален в ацетоне, чтобы сформировать наши электроды ITO. Вот блок-схема оставшихся трех шагов.

Во-первых, мы собираемся модифицировать всю поверхность с помощью колышкового цилиндра. Это сделает поверхность незагрязненной, и никакие клетки или белки не будут связываться с ней. Далее мы собираемся использовать электрохимию для специфического поглощения стержневого цилина из двух электродов, которые мы сделали ранее.

И, наконец, мы собираемся инкубировать фибробласты поверх поверхности, и они будут избирательно связываться только с полосковыми областями. Итак, теперь мы готовы начать наш эксперимент. Первым этапом является фотолитография, которую собираются проводить в чистом помещении.

Итак, давайте перейдем в чистую комнату. Итак, теперь мы находимся в нашей чистой комнате. Прежде чем мы начнем наш эксперимент, мы собираемся запечь наши образцы оксида индия и олова или покрытые покрытием ITO при температуре 200 °C в нашей духовке.

Таким образом, мы можем обезвоживать все наши поверхности. И после запекания при 200 ° C мы собираемся поместить его на нашу технологию спиннинга и фактически применить фоторезист. Итак, после обезвоживания нашего субстрата ITO, мы возьмем его и поместим на патрон крутильной техники.

Этот патрон достаточно большой, чтобы вместить четверть стеклянной лампы. Затем мы собираемся применить вакуум. После этого наносим на подложку положительный тон, фоторезист.

После нанесения фоторезиста мы просто приступаем к работе. Она включает в себя два этапа. Во-первых, это распыление, а во-вторых, нанесение слоя на этапе распыления.

Патрон вращается со скоростью 800 об/мин, что равномерно распределяет фоторезист по всей поверхности. Однако следующий шаг – это шаг спина, который находится при 4 000 оборотов в минуту и при 4 000 оборотах в минуту, он образует действительно тонкий слой. Под тонким я имею в виду около одного микрона.

Если разбить слово фото, сопротивляться, оно превращается в фото и сопротивляться. Он активируется светом. Следовательно, мы работаем в чистой комнате и используем отфильтрованный свет, чтобы наш фотодверной резист не активировался светом и был устойчив к активам, которые мы будем использовать позже, когда будем делать травление.

Итак, теперь мы закончили со спиннинговым покрытием, фоторезистом на поверхности, и мы просто собираемся убрать его и перейти к следующему шагу. Итак, после запекания образца в течение одной минуты и 45 секунд, мы собираемся снять его с горячей плиты и переместить на наш вкладыш для пушечной маски. Здесь мы берем маску, которая нам нужна, а затем помещаем маску сверху на нашу подложку, чтобы обеспечить контактную печать между нашей подложкой с портовым резистом и маской, мы помещаем ее с четырехдюймовой стеклянной пластиной, чтобы добавить ей веса.

И как только мы закончим с этим, мы просто снова ставим затвор и подвергаем образец воздействию ультрафиолетового света. Как только экспонирование завершено, мы просто отодвигаем крышку в обратном порядке. Мы вынимаем нашу стеклянную пластину, мы достаем маску, а затем мы удаляем нашу подложку и берем ее для проявки.

После предоставления образца мы помещаем его в решение разработчика. При воздействии на образец ультрафиолетового излучения образуются ионы водорода, которые нейтрализуются с помощью основания и раствора проявителя и фактически удаляются с поверхности. Итак, теперь вы хотите быть уверены, что когда вы делаете образец, вы постоянно отклоняетесь от подложки.

И когда вы это сделаете, вы сможете увидеть, что примерно через первую минуту или полторы открытые области на самом деле развиваются и удаляются с поверхности. Но для того, чтобы разработка была завершена, мы оставляем ее в решении разработчика примерно на пять минут. После того, как разработка будет завершена, мы вынимем его, промоем водой и затем высушим с помощью азотного пистолета.

Как только мы высушим наш образец, мы возьмем его и визуализируем под микроскопом. Здесь мы смотрим на образец под микроскопом. Мы просто вынули его после того, как проявили его в течение пяти минут.

Здесь вы можете увидеть две области: более темную область, которая покрыта фоторезистом, и более светлую область, где фоторезист был удален. Что касается маски, которую мы использовали ранее, более темные области на маске были более темными областями, которые мы видим сейчас под микроскопом, в то время как прозрачные области, которые мы видим здесь, были прозрачными на маске. Одна из конструкций, которая показана здесь, представляет собой массивы разных размеров от 500 до 50 микрон, в то время как другая конструкция представляет собой круги размером 1000 микрон, которые просто соединены между собой.

Так что здесь у нас другой дизайн, который был сделан по той же процедуре. Здесь у нас есть индивидуально адресуемые электроды. Я имею в виду, что различные области ITO взаимосвязаны и могут активироваться по-разному.

Например, здесь центральные круглые области подключены к одной электрической прокладке, в то время как самые внешние прямоугольные области подключены к другой электрической прокладке. Таким образом, мы можем стимулировать эти две разные поверхности в разные моменты времени. После просмотра наших образцов, следующим шагом, к которому мы переходим, является травление образца.

Те области, которые не защищены фотографиями, будут вытравлены в офорте ITO. Прежде чем это сделать, мы должны убедиться, что надели соответствующую одежду, так как травление ITO содержит кислоты. И теперь, надев защитный халат от кислоты, надев защитный щиток для лица, я собираюсь налить немного травления ITO в стеклянный стакан.

Травление ITO состоит на 20% из хлористого водорода, на 5% из азотной кислоты, а остальное — из деионизированной воды. А затем принесите мой образец и поместите его в офорт. Ранее в микроскоп мы видели, что были некоторые участки, которые не были защищены фоторейзами.

Кислоты в травлении ITO атаковали эти области и вызвали вытравливание ITO из этих областей. По мере того, как ITO медленно удаляется от поверхности, она меняет цвет. Здесь вы можете видеть, что он изменился с голубоватого изменения, которое у него было изначально, на это фиолетовое изменение, и теперь он переходит на желтый обмен.

Изменение цвета указывает на то, что ITO вытравливается. Итак, вот мы и подошли к 15 минутам. Все ITO, это полностью вытравлено.

И то, что вы видите прямо сейчас, это фотографии, защищенные регионами МТО. Таким образом, после того, как травление завершено, на поверхности все еще остаются некоторые кислоты. Чтобы удалить эту кислоту, мы поместим ее в раствор карбоната натрия, который нейтрализует всю кислоту.

После нейтрализации кислот мы собираемся извлечь его и очистить деионизированной водой, а затем высушить азотом. Итак, мы закончили с кислотным травлением. Больше никакой кислоты, я вылезла из своего горячего платья.

Мы вытащим его, перенесем и визуализируем под микроскопом. Итак, теперь мы наблюдаем образец под микроскопом. Это после того, как мы выполнили травление ITO.

В данном случае более темные области — это стеклянные области, из которых был вытравлен ITO. А более светлые участки – это ITO, которые в данном случае защищены фоторезистом. Опять же, это матрицы от 500 до 50 микрон, а в другом случае у нас есть наши взаимосвязанные круги по тысяче микрон каждая.

Так что мы просто посмотрели под микроскоп и увидели, что там были области стекла и области ITO, но области ITO были защищены фоторезистом. Теперь нам нужно вынуть этот фоторезист. Итак, все, что мы собираемся сделать, это взять наш субстрат, поместить его в ацетон, а затем поместить его в ультразвук и просто обрабатывать ультразвуком в течение 10 минут.

Это гарантирует, что все снятые фотосопротивления вы можете использовать как тоны сами по себе, но с помощью звукового удара, который использует звуковые волны для удара, и это гарантирует, что фоторезист будет правильно удален. После извлечения его из звукового воздуха, его промывают в деионизированной воде, снова сушат в азоте, и теперь вы можете четко видеть узоры на стеклянной подложке. Это были те узоры, которые изначально были защищены фоторезистом.

Теперь, когда мы рассмотрели Наши образцы и нашли или создали наши паттерны ITO, мы собираемся начать вторую фазу эксперимента. Эта фаза включает в себя модификацию поверхности самоорганизующимся монослоем циклина ПЭГ. Но прежде чем это сделать, мы должны убедиться, что поверхность реакционноспособна.

Для этого мы помещаем его в плазменный очиститель. Это вводит гидроксильные группы на поверхность и, таким образом, делает ее реакционноспособной. Для этого мы просто помещаем образец в плазменный очиститель, а затем включаем вакуумный насос.

Включаем кислород, включаем основное питание. Эта энергия используется для преобразования газообразного кислорода в плазму, которая затем вводится и, таким образом, образует гидроксильные бороздки. И как только мы включаем питание, мы идем вперед и нажимаем пуск.

Итак, теперь, после завершения процесса, мы достаем субстрат, храним его в посуде и выходим за пределы чистой комнаты и переходим к следующему шагу. Итак, теперь, когда мы вышли из чистой комнаты и закончили создание идеального узора, мы собираемся изменить поверхность, которую мы только что создали с помощью полиэтиленгликоля, CYLIN или PEG Cylin. Важно знать, что колышек цилин реагирует с влагой.

Следовательно, все, что мы используем в древесине, должно быть без влаги. Стеклянная посуда, которую мы здесь использовали, посуда для домашних животных, они были выпечены при температуре в сто градусов Цельсия на ночь. И чан, который мы будем использовать в качестве растворителя, также безводный.

Он не содержит влаги. Итак, теперь я собираюсь налить тун, безводный толу в обе эти стеклянные колонки, в одной из которых находится наш образец. Теперь нам нужно использовать две чашки Петри, потому что в одной из них мы собираемся производить модификацию.

А другой мы будем использовать позже, когда модификация закончится, чтобы фактически промыть нашу подложку. Итак, после того, как мы положили наши стеклянные формы для пиццы, я просто возьму их и переложу в нашу шлюзовую камеру здесь, в бардачке. После закрытия шлюзовой камеры мы вводим азот в камеру.

Сейчас основная камера здесь уже заполнена азотом. Следовательно, мы не хотим открывать эту камеру, если она не заполнена азотом. После того, как обе камеры будут заполнены азотом, мы собираемся перенести все наши образцы вместе с пипеткой.

У нас будет колышек и пинцет, которые мы будем использовать позже для переноса образцов. Итак, мы наденем перчатки, откроем камеру здесь и медленно и осторожно вытащим все, что у нас есть в шлюзе, и поместим его в основную камеру. Это чашка Петри с нашим субстратом и чашка Петри только с толуолом, которую мы будем использовать для мытья.

Присутствующий pxi был упакован под азот, и вы не должны открывать эту бутылку, если вы не находитесь в среде с азотом. Следовательно, однажды, когда вы хотите вынуть образец, вы кладете его обратно в сумку. Итак, вы вынимаете цилиндр, и концентрация, которую мы собираемся использовать, составляет 2% в толуоле.

Итак, вы вынимаете, кладете его в высоту, мы перемешиваем. Ну также камеру и убедитесь, что она хорошо перемешана, а затем дайте образцу инкубироваться в Тоине в течение двух часов. Итак, теперь, когда прошло два часа, наш образец находится в Pxi, мы собираемся извлечь образец и перенести его в свежий раствор, где мы кратко промоем его, развернем и переместим в нашу шлюзовую камеру.

Как только он окажется в нашей шлюзовой камере, мы просто откроем нашу камеру и вытащим нашу модифицированную поверхность, и мы сможем ездить с помощью азотного пистолета. Мы снова помещаем его в чистую сухую чашку Петри и ставим в духовку при температуре в сто градусов Цельсия еще на два часа. Итак, теперь, когда образцы запекались в духовке при температуре в сто градусов Цельсия в течение двух часов, мы собираемся взять и прикрепить наши провода к электродам, которые мы подготовили.

Мы делаем это, делая смесь серебра, эпоксидной смолы и отвердителя один к одному. Итак, это серебряная эпоксидная смола, и теперь мы добавляем в нее такое же количество отверждения. Мы хотим хорошо перемешать это, а затем возьмем это и используем для подключения наших проводов.

Итак, мы помещаем нашу проволоку на электроды, которые мы хотим использовать, а затем кодируем ее. Пайка на ИТО не работает, поэтому приходится использовать серебряную эпоксидную смолу и отвердитель. А затем мы запекаем так, чтобы весь отвердитель, который мы использовали ранее, удалился, и он затвердел, и мы можем использовать его как электрод.

Итак, теперь, когда мы закончили две фазы, мы собираемся начать третью фазу эксперимента, которая заключается в выполнении электрохимической части. Для этого мы возьмем образец и поместим его в нашу электрохимическую ячейку. После того, как мы поместили его в нашу электрохимическую ячейку, мы просто поместим на нее уплотнительное кольцо.

Это изолирует область, где будет происходить электрохимия, а затем мы просто запечатаем ячейку. Поэтому я поместил свой образец с подключенной проволокой в электрохимическую ячейку. Теперь я готов использовать характеристику потенциала для приложения напряжения.

Итак, белый провод, я собираюсь прикрепить его прямо здесь к электроду сравнения, красный, контрэлектрод, и, наконец, зеленый, который я собираюсь прикрепить к нашему рабочему электроду. Как только все эти электроды будут подключены, я просто добавлю один x раствор фосфатфосфатфосфатного буферного раствора или PBS в сам электрохимикат. Теперь, чтобы прояснить это, принцип работы заключается в том, что вся поверхность на данный момент изменена с помощью pxi.

Таким образом, все электроды, включая окружающие области стекла, модифицируются с помощью pxi. Как только я подам напряжение везде, где присутствует ITO, а это конструкции электродов, которые мы сделали, остров колышков будет отрываться только от этой поверхности, и это ничего не повлияет на окружающие области. Следовательно, мы выборочно удаляем колышковый островок с нашего субстрата.

Итак, теперь я нажму кнопку воспроизведения, и это запустится и подаст напряжение отрицательного напряжения 1,4 вольта на наш рабочий электрод. При подаче напряжения происходит изменение цвета, которое можно увидеть на электродах. Он меняется от прозрачного зеленовато-голубого тинга, который у нас был, до коричневого.

Мы подозреваем, что на электродах может происходить реакция окисления, которая заставляет их становиться коричневыми. Это тоже один из индикаторов того, что pxi с поверхности действительно был оторван от поверхности. И снова, где бы вы ни увидели коричневый цвет, именно отсюда был удален остров с колышками.

А на окружающих стеклянных областях до сих пор собран PXI. Поэтому мы подаем напряжение отрицательного напряжения 1,4 Вт в течение 60 секунд. Это дает достаточно времени для удаления всех pxi, которые присутствовали на электродах.

Мы также можем использовать этот метод для снятия изоляции электродов с индивидуальным адресом. В данном случае было три ряда кругов, которые будут сняты. Мы можем выбрать, какие из них мы хотим зачистить, используя все три разных электрода.

Итак, теперь мы успешно завершили нашу третью часть электрохимии, в которой мы выборочно удалили PG siling из наших электродов ITO. Я коротко промыл его водой PBS и DI, удалил проволоку и поместил образцы в обычные шестилуночные планшеты. Теперь мы перейдем к культивируемым клеткам на этих электродах.

Итак, теперь мы находимся в комнате для культивирования тканей. На заключительном этапе эксперимента мы сегодня будем использовать фибробласты, три Т-три клетки. Концентрация, которую мы используем для засеивания клеток, составляет от 0,5 до 1,5 миллиона клеток на мил.

После засеивания клеток мы помещаем их на наш образец примерно на 20 минут. Это дало бы ему достаточно времени, чтобы прикрепить его к зачищенным областям. Поэтому мы поместим его в инкубатор.

Итак, прошло 20 минут, и мы готовы посмотреть на клетки, которые образовались на полосатых участках ITO, коричневых областях, которые мы видели ранее, и они будут только специфически связываться с этими областями и не будут прикрепляться нигде за пределами этих областей. Здесь вы можете видеть, что коричневые области были регионами ITO, которые были лишены pxi. С помощью электрохимии клетки прикрепляются только к этим коричневым областям, а не к окружающим стеклянным областям.

На этом другом кадре, опять же, мы видим сельц, прикрепляющийся к обнаженным областям. Это коричневые области, но над этими коричневыми областями вы едва можете видеть, и ITO design PEG не был убран из этого дизайна ITO, поэтому к нему не прикреплены клетки. Ладно, вот и все.

Мы закончили с протоколом, и клетки имеют рисунок на электродах ITO, и это именно то, чего мы хотели. Я только что показал вам контроль адгезии клеток на микро изготовленных оптически прозрачных электродах из оксида индия 10. Сегодня я показал вам, как создать три фибробласта на этих электродах.

Мы также использовали ту же процедуру для моделирования двух клеток Hep G, сателлитных клеток и первичных клеток крысы. Современные методы структурирования ячеек позволяют собирать на поверхности только два типа ячеек. Гибкость этого метода позволит в будущем собирать на поверхности несколько типов клеток, которые будут пространственно изолированы.

Мы планируем использовать этот метод для пространственной изоляции трех различных типов клеток печени на субстрате ITO, чтобы имитировать микроокружение in vivo. Таким образом, мы можем пространственно изолировать незрелые клетки или стволовые клетки вместе со зрелыми клетками и поддерживающими клетками. Это создаст благоприятную среду для роста и дифференцировки незрелых клеток.