Структурирование Ячейки оптически прозрачные электроды индия оксид олова

Здравствуйте, меня зовут Иша. Я аспирантка второго года обучения в лаборатории доктора Зена. Мы находимся на кафедре биомедицинской инженерии Калифорнийского университета в Дейвисе.

Сегодня я продемонстрирую вам управление ионами на микроизготовленных оптически прозрачных электродах из оксида индия-олова. В области тканевой инженерии и регенерации предпринимаются попытки имитировать микроокружение органа. Чтобы создать такое микроокружение in vitro, необходимо обеспечить пространственную и временную изоляцию клеток на подложке. Нас интересует разработка поверхностей, позволяющих контролировать расположение различных типов клеток печени.

В сегодняшнем эксперименте мы воспользуемся модификацией поверхности, микрофабрикацией и электрохимией для создания поверхности, которая может переключаться из состояния, не способствующего адгезии клеток, в состояние, способствующее их адгезии. Первым этапом является фотолитография. Ниже представлена блок-схема того, как будет проходить этот процесс.

Синим цветом обозначен стеклянный световод, зеленым — оксид индия 10, нанесенный поверх него. Сначала мы нанесем методом центрифугирования фоторезист red, показанный здесь, на стеклянный световод с покрытием из оксида индия 10. Затем мы подвергнем его воздействию ультрафиолетового излучения через фотошаблон, после чего экспонированные области будут проявлены в растворе проявителя.

Области ITO, не защищенные фоторезистом, будут удалены при травлении ITO. Затем, наконец, весь оставшийся фоторезист будет удален в ацетоне для формирования наших электродов из ITO. Ниже представлена блок-схема оставшихся трех этапов.

Сначала мы модифицируем всю поверхность PEG-циллином. Это придаст поверхности антифоулинговые свойства, что предотвратит связывание с ней клеток или белков. Затем с помощью электрохимического метода мы селективно адсорбируем PEG-циллин на двух электродах, которые были изготовлены ранее.

И наконец, мы инкубируем фибробласты на поверхности, и они будут селективно связываться только с областями полос. Теперь мы готовы приступить к эксперименту. Первый этап включает фотолитографию, которая будет проводиться в чистом помещении.

Перейдем в чистое помещение. Теперь мы находимся в чистой зоне. Перед началом эксперимента мы подвергнем образцы с покрытием из оксида индия-олова или ITO отжигу в печи при 200 °C.

Таким образом мы сможем обезводить все поверхности. После прокаливания при 200 C мы поместим подложку на центрифугу для нанесения покрытий (spin tech) и нанесем фоторезист. После обезвоживания подложки ITO мы возьмем ее и установим на зажим центрифуги.

Этот зажим достаточно велик, чтобы удерживать четверть стеклянной пластины. Затем мы создадим вакуум. После этого на подложку наносится позитивный фоторезист.

После нанесения фоторезиста мы приступаем к работе. Этот процесс состоит из двух этапов: сначала следует распределение, а затем — центрифугирование (спин-коутинг) на этапе распределения.

Патрон вращается со скоростью 800 RPM, что обеспечивает равномерное распределение фоторезиста по всей поверхности. Следующим этапом является центрифугирование при 4 000 RPM, при котором формируется очень тонкий слой. Под тонким я подразумеваю толщину около 1 microns.

Если разделить слово photoresist (фоторезист), оно состоит из «фото» и «резист». Он активируется светом. Поэтому мы работаем в чистой комнате и используем фильтрованный свет, чтобы наш фоторезист не активировался под воздействием света; кроме того, он устойчив к воздействию кислот, и именно этим свойством мы воспользуемся позже при проведении травления.

Таким образом, процесс центрифугирования завершен, поверхность покрыта фоторезистом; теперь мы извлекаем образец и переходим к следующему этапу. После запекания образца в течение 1 минуты и 45 секунд мы снимаем его с нагревательной плитки и переносим в установку для выравнивания масок Cannon. Здесь мы берем необходимую маску и помещаем ее поверх подложки; чтобы обеспечить контактную печать между подложкой с фоторезистом и маской, мы прижимаем конструкцию стеклянным лоскутом диаметром 4 дюйма для создания дополнительного веса.

Завершив эту операцию, мы устанавливаем затвор на место и подвергаем образец воздействию УФ-излучения. По окончании экспонирования мы снимаем крышку в обратном порядке. Извлекаем стеклянную подложку, снимаем маску, затем извлекаем наш субстрат и переносим его для проявления.

После экспонирования образец помещают в проявитель. При воздействии УФ-излучения образуются ионы водорода, которые нейтрализуются основанием в растворе проявителя и удаляются с поверхности. Поэтому при обработке образца необходимо постоянно перемещать подложку.

В этом случае можно заметить, что примерно в первую минуту или полторы минуты открытые области фактически проявляются и удаляются с поверхности. Однако для полного проявления мы оставляем образец в растворе проявителя примерно на пять минут. После завершения проявления мы извлечем его, промоем в деионизированной воде, а затем высушим с помощью азотной пушки.

После высушивания образца мы перенесем его для визуализации под микроскопом. Сейчас мы рассматриваем образец под микроскопом; он был извлечен после пятиминутного проявления.

Здесь видны две области: более темная область, покрытая фоторезистом, и более светлая область, где фоторезист был удален. Если соотнести это с маской, которую мы использовали ранее, темные области на маске соответствуют темным областям, которые мы сейчас видим под микроскопом, в то время как светлые области здесь были прозрачными на маске. Один из представленных здесь образцов представляет собой массивы различных размеров — от 500 до 50 микрон, в то время как другой образец состоит из взаимосвязанных кругов диаметром 1000 микрон.

Здесь представлен другой вариант конструкции, созданный по той же методике. В данном случае используются индивидуально адресуемые электроды. Это означает, что различные области ITO взаимосвязаны и могут активироваться независимо друг от друга.

Например, здесь центральные круглые области подключены к одному электрическому контакту, в то время как крайние прямоугольные области подключены к другому электрическому контакту. Таким образом мы можем стимулировать эти две разные поверхности в разные моменты времени. После осмотра образцов мы переходим к следующему этапу — травлению образца.

Все области, не защищенные фоторезистом, будут удалены при травлении ITO. Прежде чем приступить к этому, необходимо убедиться, что надеты соответствующие защитные средства, так как раствор для травления ITO содержит кислоты. Теперь, надев кислотозащитный халат и лицевой щиток, я налью раствор для травления ITO в стеклянный стакан.

Раствор для травления ITO состоит из 20% хлороводорода, 5% азотной кислоты, остальное — деионизированная вода. Затем возьмите образец и поместите его в раствор для травления. Ранее при осмотре под микроскопом мы заметили, что некоторые области не были защищены фоторезистом.

Кислоты, используемые для травления ITO, воздействовали на эти области, что привело к вытравливанию ITO из данных зон. По мере постепенного разрушения ITO на поверхности меняется его цвет. Здесь видно, что цвет изменился с первоначального голубоватого оттенка на пурпурный, и теперь он переходит в желтый.

Изменение цвета указывает на то, что происходит травление ITO. Итак, прошло 15 минут. Весь слой ITO полностью вытравлен.

На фотографиях, которые вы видите сейчас, представлены защищенные области ITO. После завершения травления на поверхности все еще остаются кислоты. Чтобы удалить их, мы поместим образец в раствор карбоната натрия, который нейтрализует всю кислоту.

После нейтрализации кислот мы извлечем образец, промоем его деионизированной водой и высушим потоком азота. Таким образом, травление кислотой завершено. Работа с кислотами окончена, я снимаю защитный халат.

Мы извлечем его, перенесем и визуализируем под микроскопом. Теперь мы наблюдаем образец под микроскопом. Это результат после проведения травления ITO.

В данном случае более темные области представляют собой участки стекла, с которых был удален слой ITO путем травления. Более светлые области — это участки ITO, которые в данном случае были защищены фоторезистом. Еще раз отметим, что это массивы от 500 до 50 микрон, а в другом случае мы имеем взаимосвязанные круги диаметром по 1000 микрон каждый.

Итак, мы только что осмотрели образец под микроскопом и увидели области стекла и области ITO, при этом области ITO были защищены фоторезистом. Теперь нам необходимо удалить этот фоторезист. Для этого мы поместим подложку в ацетон, затем перенесем ее в ультразвуковую ванну и будем подвергать ультразвуковой обработке в течение 10 минут.

Это гарантирует удаление всего фоторезиста; можно использовать проявление, но для этого применяется ультразвуковая очистка, при которой воздействие звуковых волн обеспечивает правильное удаление фоторезиста. После извлечения из ультразвуковой ванны образец промывают в деионизированной воде, снова высушивают потоком азота, и теперь на стеклянной подложке четко видны структуры. Именно эти структуры изначально были защищены фоторезистом.

Теперь, когда мы изучили наши образцы, нашли или создали паттерны из ITO, мы приступаем ко второму этапу эксперимента. Этот этап включает модификацию поверхности самоорганизующимся монослоем PEG-циклина. Однако прежде чем приступить к этому, необходимо убедиться, что поверхность обладает реакционной способностью.

Для этого мы помещаем образец в установку для плазменной очистки. Это позволяет ввести гидроксильные группы на поверхность, тем самым делая ее реакционноспособной. Для этого мы просто помещаем наш образец в плазменный очиститель, а затем включаем вакуумный насос.

Мы включаем подачу кислорода и подаем основное питание. Эта энергия используется для преобразования газообразного кислорода в плазму, которая затем подается в систему, формируя гидроксильные канавки. После включения питания мы нажимаем кнопку пуска.

После завершения процесса мы извлекаем подложку, помещаем её в чашку Петри, выходим из чистого помещения, снимаем защитную одежду и переходим к следующему этапу. Теперь, когда мы покинули чистое помещение и завершили формирование идеального паттерна, мы модифицируем полученную структуру с помощью полиэтиленгликоль-силана (PEG silane). Важно помнить, что PEG silane чувствителен к влаге.

Следовательно, все используемые нами деревянные изделия должны быть полностью обезвожены. Стеклянная посуда, включая чашки Петри, которые мы здесь используем, подвергалась прогреву при 100 °C в течение ночи. Кроме того, толуол, который мы будем использовать в качестве растворителя, также является безводным.

Он не содержит влаги. Теперь я налью безводный толуол в обе эти стеклянные стаканы, в одном из которых находится наш образец. Нам понадобятся две чашки Петри, так как в одной из них мы будем проводить модификацию.

А второй我们将 использовать позже, после завершения модификации, для промывки субстрата. Поместив их в стеклянные чашки Петри, я перенесу их в шлюзовую камеру перчаточного бокса. После закрытия шлюзовой камеры мы подадим в неё азот.

На данный момент основная камера уже заполнена азотом. Поэтому мы не открываем эту камеру, пока она не будет заполнена азотом. Как только обе камеры будут заполнены азотом, мы перенесем все наши образцы с помощью пипетки.

Нам понадобятся зажим и пинцет, которые мы будем использовать позже для переноса образцов. Наденем перчатки, откроем камеру и медленно и осторожно перенесем все содержимое из шлюза в основную камеру. Это чашка Петри с нашим субстратом и чашка Петри только с толуолом, который мы будем использовать для промывки.

Присутствующий pxi был упакован в среде азота, поэтому не следует открывать этот флакон, если вы находитесь не в азотной среде. Таким образом, при извлечении образца его необходимо возвращать обратно в пакет. Возьмите цилиндр; мы будем использовать концентрацию 2% в толуоле.

Затем вы извлекаете образец, помещаете его в высокую пробирку и перемешиваете. Мы также используем камеру, чтобы убедиться, что смесь однородна, после чего оставляем образец инкубироваться в Toin на два часа. Теперь, когда два часа прошли и образец находился в Pxi, мы извлекаем его и переносим в свежий раствор toin, где проводим краткую промывку, аккуратно перемешивая образец, а затем перемещаем его в шлюзовую камеру.

Когда образец окажется в шлюзовой камере, мы просто откроем камеру, извлечем модифицированную поверхность и переместим ее с помощью азотного пистолета. Снова поместите образец в чистую сухую чашку Петри, затем перенесите его в печь при температуре 100 °C еще на два часа. Теперь, когда образцы были высушены в печи при 100 °C в течение двух часов, мы приступим к подключению проводов к подготовленным электродам.

Для этого мы готовим смесь серебряного эпоксидного клея и отвердителя в соотношении один к одному. Перед нами серебряный эпоксидный клей, теперь добавим в него такое же количество отвердителя. Необходимо тщательно перемешать компоненты, после чего мы будем использовать полученный состав для закрепления проводов.

Мы размещаем провод на электродах, которые планируем использовать, а затем фиксируем его. Пайка не работает с ITO, поэтому нам приходится использовать серебряный эпоксидный клей и отвердитель. Затем мы подвергаем образец термической обработке, чтобы удалить использованный ранее отвердитель и обеспечить затвердевание соединения, после чего его можно использовать в качестве электрода.

Теперь, когда мы завершили две фазы, мы приступим к третьей фазе эксперимента — проведению электрохимической части. Для этого мы возьмем образец и поместим его в электрохимическую ячейку. После размещения образца в электрохимической ячейке мы просто установим сверху уплотнительное кольцо.

Это позволит изолировать область, в которой будут происходить электрохимические реакции, после чего мы просто герметизируем ячейку. Таким образом, я поместил образец с прикрепленным проводом в электрохимическую ячейку. Теперь я готов использовать потенциостат для подачи напряжения.

Таким образом, белый провод я прикреплю здесь, к электроду сравнения, красный — к вспомогательному электроду, и, наконец, зеленый я прикреплю к нашему рабочему электроду. После того как все электроды будут подключены, я просто добавлю 1x раствор фосфатно-солевого буфера (PBS) в саму электрохимическую ячейку. Теперь для уточнения: на данный момент вся поверхность модифицирована pxi.

Таким образом, все электроды, включая окружающие стеклянные области, модифицированы pxi. После подачи напряжения во все области, где присутствует ITO (что соответствует созданной нами конфигурации электродов), ПЭГ-островки будут удалены только с этих поверхностей, в то время как окружающие области останутся незатронутыми. Таким образом, мы селективно удаляем ПЭГ-островки с нашей подложки.

Теперь я нажму кнопку воспроизведения, и на наш рабочий электрод будет подано напряжение -1,4 volts. При подаче напряжения на электродах заметно изменение цвета: прозрачный зеленовато-голубой оттенок сменяется коричневым.

Мы предполагаем, что на электродах может происходить реакция окисления, которая приводит к их побурению. Это также является одним из признаков того, что pxi действительно был удален с поверхности. И снова подчеркнем: любое побурение указывает на место, где PEG-островок был удален.

При этом на окружающих стеклянных областях все еще остается собранный PXI. Поэтому мы подаем напряжение -1,4 В в течение 60 секунд. Этого времени достаточно, чтобы удалить весь PXI, который присутствовал на электродах.

Этот метод также можно использовать для очистки электродов с индивидуальной адресацией. В данном случае очистке подлежали три ряда кругов. Мы можем выбрать, какие именно из них необходимо очистить, используя все три различных электрода.

Таким образом, мы успешно завершили третью часть электрохимического этапа, в ходе которой селективно удалили слой PG с наших электродов ITO. Я кратко промыл их PBS и деионизированной водой, удалил провода и поместил образцы в обычные 6-луночные планшеты. Теперь мы перейдем к культивированию клеток на этих электродах.

Теперь мы находимся в помещении для культивирования тканей. На заключительном этапе эксперимента мы будем использовать фибробласты, линию клеток 3T3. Для посева клеток мы используем концентрацию от 0.5 до 1.5 миллионов клеток на мл.

После посева клеток мы оставляем их на образце примерно на 20 минут. Это обеспечит достаточное время для их прикрепления к очищенным участкам. Поэтому мы поместим образец в инкубатор.

Прошло 20 минут, и теперь мы готовы осмотреть клетки, которые распределились по очищенным участкам ITO — тем коричневым областям, которые мы видели ранее; клетки должны связываться специфично только с этими участками и не прикрепляться за их пределами. Здесь видно, что коричневые области представляют собой участки ITO, с которых был удален pxi. Благодаря электрохимическому методу клетки прикрепились только к этим коричневым областям, не затрагивая окружающие участки стекла.

На этом другом кадре мы снова видим, как клетки прикрепляются к очищенным участкам. Это коричневые области; однако над ними едва заметен слой ПЭГ на поверхности ITO, который не был удален, поэтому к нему клетки не прикрепились. Итак, на этом всё.

Протокол завершен, и клетки образовали рисунок на ITO-электродах, что и было нашей целью. Я только что продемонстрировал вам управление адгезией клеток на микроизготовленных оптически прозрачных электродах из оксида индия-олова. Сегодня я показал вам, как создавать паттерны из трех фибробластов на этих электродах.

Мы также использовали ту же процедуру для создания паттернов из клеток Hep G two, сателлитных клеток и первичных клеток крысы. Современные методы паттернирования клеток позволяют собирать на поверхности только два типа клеток. Гибкость данного метода в будущем позволит собирать на поверхности несколько типов клеток, пространственно изолированных друг от друга.

Мы планируем использовать этот метод для пространственной изоляции трех различных типов клеток печени на подложке из ITO, чтобы имитировать микроокружение in vivo. Таким образом мы сможем пространственно разделить незрелые клетки или стволовые клетки, а также зрелые и поддерживающие клетки. Это создаст стимулирующую среду для роста и дифференцировки незрелых клеток.