Отказ от флуоресцентного фона в резонанс и СКР микроспектроскопия

Целью данной процедуры является создание полностью оптического затвора, который пропускает рамановское рассеянное излучение, отсекая при этом флуоресцентные сигналы. Это достигается путем первоначального возбуждения и поляризации рамановского рассеяния. Вторым этапом процедуры является подготовка пучка накачки для управления затвором.

В-третьих, необходимо настроить насос, рамен-импульсы и их временную синхронизацию таким образом, чтобы они перекрывались. Заключительным этапом процедуры является получение спектров с временным гейтированием. В конечном итоге можно получить результаты, которые позволяют проводить биохимический количественный анализ и классификацию путем анализа рамен-сигналов с высоким отношением сигнал/шум.

Основным преимуществом данного метода по сравнению с существующими способами, такими как программное удаление флуоресцентного фона, является значительное снижение уровня дробового шума, создаваемого флуоресценцией. Этот метод может помочь в решении ключевых вопросов в области биологии и биомедицины, таких как неинвазивная характеристика химического состава эндогенных флуорофоров в клетках бактерий и тканях, а также понимание клеточных процессов и таких заболеваний, как рак, сосудистые или нейродегенеративные заболевания, с использованием внутренних маркеров. Кроме того, данный метод может способствовать разработке новых зондов, которые могли бы использоваться в качестве меток как для флуоресценции, так и для RAM, а также для создания неинвазивных медицинских сенсоров для анализа крови.

Хотя этот метод позволяет получить представление о биологических системах для биомедицинской инженерии, он также может быть применен в других областях, таких как исследования в сфере биотоплива или телекоммуникационная промышленность. Биологические образцы обычно помещают на покровное стекло толщиной № 1, закрепленное в кювете ATO Fluor.

Жидкие образцы, особенно токсичные для человека, помещают в небольшой стеклянный флакон, отверстие которого заклеивают покровным стеклом с помощью силиконового эпоксидного клея. Затем флакон переворачивают для измерения и устанавливают образцы на вспомогательный предметный столик, смонтированный поверх основного столика микроскопа, который имеет собственный независимый контроль фокусировки. Для получения спектров КР с временным разделением сигналов сначала необходимо соответствующим образом подготовить возбуждающий пучок. Источником служит свет от перестраиваемого импульсного сапфирового лазера Ti:sapphire мощностью 2,4 Вт. Каждый импульс в последовательности с частотой 80 МГц должен иметь энергию 30 нДж, длительность 140 фс и спектр с центром на 808 нм и спектральной шириной около 6 нм. Чтобы предотвратить попадание обратных отражений в резонатор лазера, свет должен проходить через изолятор Фарадея; перед изолятором Фарадея установите полуволновую пластинку для непрерывного регулирования общей мощности, подаваемой в систему.

Поскольку полоса пропускания в 6 нм слишком широка для разрешения большинства рамановских мод, пучок пропускают через узкополосный фильтр. Установите длину волны 808 нм. Затем используйте ахроматический дублет, чтобы сфокусировать свет на кристалле бета-бората бария размером 5 мм.

Используйте кристалл для удвоения частоты, чтобы перевести длину волны с 808 нанометров на 404 нанометра. Поместите кристалл бета-бората бария в держатель с регуляторами наклона и поворота, установленный на перемещающем столике. Для максимальной эффективности преобразования длины волны кристалл должен быть расположен точно симметрично относительно фокуса дублета, а его кристаллическая ось должна быть согласована с поляризацией падающего пучка.

Поскольку эффективность преобразования длины волны зависит от поляризации, управление количеством света, направляемого на образец, можно осуществлять путем размещения второй полуволновой пластинки после фарадеевского изолятора. Поворачивая эту пластинку, можно регулировать интенсивность света, подаваемого на образец, независимо от интенсивности пучка накачки. Затем свет с преобразованной длиной волны снова коллимируется с помощью второго ахроматического дублета, подобранного таким образом, чтобы возбуждающий пучок был достаточно большим для заполнения задней апертуры объектива микроскопа, и направляется в инвертированный микроскоп с помощью двух управляющих зеркал.

Объектив микроскопа определяет оптическую ось, по которой необходимо центрировать возбуждающий пучок. Поместите зеркало в плоскость образца микроскопа. Затем последовательно настраивайте два управляющих зеркала, наблюдая за отраженным лазерным пучком на ПЗС-камере, подключенной к порту визуализации микроскопа.

При условии, что изображение на камере центрировано по полю зрения микроскопа, пучок находится на оси. Когда фокальное пятно центрировано на чипе микроскопа и перемещение объектива по оси Z не вызывает изменений. Центральная точка рамановского рассеяния расфокусированного пучка возникает, когда образец помещается в плоскость образца и облучается лазерным светом.

Дихроичный фильтр, расположенный под объективом микроскопа, отделяет смещенный по длине волны рамановский рассеянный свет от возбуждающего пучка, направляя рамановский рассеянный свет в боковой порт микроскопа. Конструкция микроскопа была изменена путем удаления всех линз на этом пути, чтобы световой сигнал выходил из микроскопа параллельно, поскольку пучок сигнала, выходящий из микроскопа, больше, чем световая апертура объектива.

Для сужения пучка используются поляризаторы Томпсона и телескоп с коэффициентом 0,47, состоящий из двух ароматических дублетов. Затем сигнальный свет поляризуется с помощью поляризатора Томпсона с зажимным устройством, ориентированного под углом ноль градусов относительно вертикали в лабораторной системе координат, и направляется на дихроичное зеркало, где он объединяется с пучком накачки. Пучок накачки направляется в линию задержки, состоящую из двух зеркал, расположенных под прямым углом друг к другу; оба зеркала установлены на линейном перемещающем столике, который можно настраивать для обеспечения временного перекрытия импульсов накачки и сигнала.

После линии задержки пучок проходит через полуволновую пластинку и поляризатор, ориентированные под углом 45 градусов относительно вертикали в лабораторной системе координат. Это обеспечивает надлежащее состояние поляризации накачки при ее попадании в нелинейную среду. Затем свет отражается от двух направляющих зеркал, одно из которых оснащено пьезоэлектрическими приводами; их следует использовать для окончательной юстировки положения пучка накачки таким образом, чтобы он пространственно перекрывался с сигнальным пучком.

Для достижения этого перекрытия необходимо наблюдать за пучками накачки и сигнала в двух точках: одной — вблизи, а другой — вдали от дихроичного зеркала, где пучки объединяются. Используйте первое управляющее зеркало для перекрытия двух пучков в ближней точке и пьезозеркало для перекрытия пучков в дальней точке; таким образом пучок накачки можно сделать точно коллинеарным пучку сигнала. Далее следует настроить систему коругации и сбора данных для максимизации собранного временного затворного сигнала. Для этого пучки накачки и сигнала сначала пропускают через диичный фильтр с OD, равным шести при 404 нанометрах, чтобы предотвратить возбуждение и рассеяние остаточного возбуждающего света внутри нелинейной среды.

Затем пучки накачки и сигнала фокусируются с помощью ахроматического дублета в кварцевую кювету с длиной оптического пути один сантиметр, содержащую нелинейный материал; может быть использован любой нелинейный материал с достаточно высоким показателем нелинейности и достаточно коротким временем отклика. В данных экспериментах мы используем сероуглерод. Затем свет снова коллимируется вторым дублетом с фокусным расстоянием, идентичным первому.

Затем пучки проходят через анализатор Глэнда-Томпсона на поворотном креплении, а затем через набор абсорбционных и интерференционных фильтров, суммарная оптическая плотность (OD) которых составляет 10 на длине волны 808 нанометров. В завершение сигнальный свет фокусируется ахроматическим дублетом в многомодовое оптическое волокно диаметром 50 микрон, при этом волокно установлено в столике, обеспечивающем перемещение по осям X, Y и Z. Затем волокно соединяют с коммерческим изображающим спектрографом с подключенной ПЗС-камерой, чтобы выровнять систему сбора для максимизации регистрируемого сигнала, установить анализатор на ноль градусов и поместить тестовый образец толуола в плоскость образца, а затем оптимизировать регистрируемый сигнал комбинационного рассеяния, регулируя приводы X, Y и Z крепления волокна для обеспечения надлежащего пространственного и временного перекрытия пучков накачки и сигнала. Поместите зеркало в плоскость образца микроскопа.

Затем извлеките из системы фильтр 404 нм. Поверните анализатор на 90 градусов так, чтобы обратно отраженный пучок 404 нм направлялся в спектрограф при интенсивности, отрегулированной таким образом, чтобы не произошло насыщение камеры. Теперь, выключив пучок накачки, поверните анализатор так, чтобы минимизировать прошедший сигнал 404 нм.

Затем снова включите пучок накачки и медленно регулируйте стадию задержки, пока пропускание света с длиной волны 404 нанометра не начнет увеличиваться. Далее итеративно настраивайте стадию задержки, пьезоэлектрическое зеркало, а также регуляторы X, Y и Z волокна для максимизации сигнала, так как ретроотраженный пучок 404 нанометра и рамановски рассеянный свет могут проходить по слегка различающимся путям в системе. Выполните окончательную юстировку, поместив на предметный столик сильный рамановский рассеиватель, например толуол, заменив рамановский фильтр и слегка подкорректировав настройку путем изменения положения стадии задержки, пьезоэлектрического зеркала и регуляторов X, Y и Z волокна для оптимизации рамановского сигнала.

Теперь система готова к сбору спектров. Для этого сначала необходимо получить несколько фоновых кривых, чтобы скорректировать системные артефакты. Сначала установите анализатор на ноль градусов, включите луч возбуждения и выключите луч накачки.

Получите спектр без использования вентилятора (ungated spectrum), затем установите анализатор под углом 90 градусов и соберите фоновый спектр, представляющий собой рассеянный свет, проходящий через поляризаторы. Далее, оставив анализатор под углом 90 градусов, выключите рамановский пучок и включите пучок накачки. Соберите второй фоновый спектр, представляющий количество света накачки, проходящего через дихроичные фильтры.

Наконец, при выключенных лазерах снимите базовый спектр темного тока, который характеризует уровень темнового тока камеры и электроники. Затем включите все лучи и снимите спектр с использованием затвора. Чтобы получить истинный спектр только того света, который проходит через затвор, из этого спектра с затвором необходимо вычесть два фоновых спектра и спектр темного тока.

Здесь представлена схематическая диаграмма системы гофрирования. Путь пучка накачки показан сплошной красной линией, а путь SHG — сплошной темно-синей линией. Путь, где перекрываются рамановский сигнал и флуоресценция, показан зеленым цветом.

В то время как путь, на котором флуоресценция была временно отфильтрована, показан желтым цветом. Здесь представлены необработанные спектры кумарина, растворенного в иммерсионном масле. Красная кривая демонстрирует спектр, полученный при открытом затворе, а черная кривая — спектр, полученный при настройке анализатора на минимальное пропускание и при воздействии накачивающего пучка.

Синяя кривая представляет спектр, полученный при настройке анализатора на минимальное пропускание без воздействия пучка накачки, а зеленая кривая — спектр, полученный только при воздействии пучка накачки. Все спектры были сглажены с помощью 11-точечного фильтра Кай-Гоула (KY gole) третьего порядка. Пунктирные пурпурные линии указывают на спектральную область, показанную на следующем графике.

Здесь представлены спектры кумарина, растворенного в иммерсионном масле, после вычитания фона флуоресценции. Красная кривая соответствует спектру с открытым затвором, а синяя кривая — спектру с закрытым затвором. В спектре с закрытым затвором отчетливо виден сложный пик в области высоких волновых чисел, характерный для масел.

При выполнении данной процедуры важно помнить, что лазер должен обладать достаточной энергией импульса для возбуждения ga, а система требует прецизионного пространственного и временного перекрытия двух импульсов. После просмотра этого видео и ознакомления с прилагаемым протоколом вы должны четко представлять, как разделить лазерный луч на луч возбуждения и кривой луч, а также как обеспечить их перекрытие как в пространстве, так и во времени.

Как зарегистрировать рамановский сигнал с помощью спектрографа и компьютера, а также как визуализировать и анализировать рамановский сигнал. Не забывайте, что работа с лазерами может быть чрезвычайно опасной, и при выполнении данной процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как использование защитных лазерных очков. Дополнительные правила техники безопасности относятся к использованию нелинейного материала и конкретно вашего образца.