Отказ от флуоресцентного фона в резонанс и СКР микроспектроскопия

Мы обсуждаем строительство и эксплуатация сложных нелинейных оптической системой, которая использует сверхбыстрый все-оптической коммутации, чтобы изолировать от комбинационного сигналов флуоресценции. С помощью этой системы мы можем успешно отдельных комбинационного и сигналов флуоресценции использования энергии импульсов и средней мощности, которые остаются биологически безопасна.

Целью этой процедуры является построение полностью оптической походки, которая пропускает комбинационный рассеянный свет, подавляя флуоресцентные сигналы. Это достигается путем возбуждения и поляризации комбинационного рассеяния. Вторым этапом процедуры является подготовка балки насоса к работе затвора.

В-третьих, насос и плунжер и импульсы должны быть отрегулированы так, чтобы они перекрывались. Заключительным этапом процедуры является получение спектров с временным стробированием. В конечном счете, могут быть получены результаты, которые показывают биохимическую количественную оценку и классификацию посредством анализа сигналов рамена с высоким соотношением сигнал/шум.

Основное преимущество этого метода перед существующими методами, такими как программное удаление флуоресцентного фона, заключается в том, что дробовой шум, производимый флуоресценцией, значительно снижается. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в биологической и биомедицинской областях, такие как неинвазивная характеристика химического состава эндогенного фтора в клетках и тканях бактерий, понимание клеточных процессов и заболеваний, таких как рак, сосудистые или нейродегенеративные заболевания, с использованием внутренних маркеров. Этот метод также может помочь в разработке новых зондов, которые можно было бы использовать как в качестве флуоресцентных и RAM-меток, так и в качестве неинвазивных медицинских датчиков для анализа крови.

Тем не менее, этот метод может дать представление о биологических системах для биомедицинской инженерии. Он также может быть применен в других областях, таких как биотопливо, исследования или телекоммуникационная промышленность. Биологические образцы обычно помещаются на крышку толщиной номер один, установленную в камере с флюористыми элементами ATO.

Жидкие пробы, особенно токсичные для человека, помещаются в маленькую стеклянную бутылку с крышкой, прикрепленной к отверстию с помощью силиконовой эпоксидной смолы, которая затем переворачивается для измерения и помещается на вторичный предметный столик, установленный в верхней части предметного столика микроскопа, который имеет свой собственный независимый контроль фокусировки для того, чтобы измерять время спектров рамена. Во-первых, необходимо правильно подготовить возбуждающий пучок. Начните со света, исходящего от перестраиваемого импульсного сапфирового лазера GI мощностью 2,4 Вт. Каждый импульс в последовательности импульсов 80 мегагерц должен иметь энергию 30 наноджоулей, временную ширину 140 фемтосекунд и спектр с центром в 808 нанометров со спектральной полосой пропускания около шести нанометров, чтобы предотвратить повторное попадание обратных отражений в резонатор лазера, свет должен пропускаться через изолятор Фарадея, полуволновую пластину перед изолятором Фарадея, чтобы обеспечить непрерывную настройку общей мощности, посылаемой в изолятор. система.

Поскольку шесть нанометров — это слишком широкая полоса для разрешения большинства мод рамэна, луч пропускается через фильтр с очень узкой полосой. Отправьте его на 808 нанометров. Затем используйте ароматический дублет, чтобы сфокусировать свет на пятимиллиметровом отверстии с бета-барием.

Восемь кристаллов на половину длины волны от 808 нанометров до 404 нанометров. Поместите кристалл бета-бария в крепление с наконечником и регуляторами наклона, установленное на предметном столике. Чтобы максимизировать эффективность преобразования длины волны, кристалл должен быть размещен точно симметрично относительно фокуса дублета, а его ось кристалла должна быть выровнена по поляризации входящего луча.

Поскольку эффективность преобразования длины волны зависит от поляризации, контроль над количеством света, посылаемого на образец, может быть получен путем размещения второй полуволновой пластины после изолятора Фарадея. Вращая эту волновую пластину, интенсивность света, посылаемого на образец, может быть отрегулирована независимо от интенсивности, подаваемой в луч насоса. Преобразованный свет на длину волны затем повторно коллимируется вторым ароматическим дуплетом, выбранным таким образом, чтобы возбуждающий луч был достаточно большим, чтобы заполнить заднюю апертуру объектива микроскопа, и направляется в инвертированный микроскоп с помощью двух управляющих зеркал.

Объектив микроскопа определяет оптическую ось для выравнивания возбуждающего луча по этой оси. Поместите зеркало в плоскость образца микроскопа. Затем два рулевых зеркала итеративно настраиваются при наблюдении за отраженным лазерным лучом на ПЗС-камере, прикрепленной к порту изображения микроскопа.

Предполагая, что изображение на камере центрировано в поле зрения микроскопа, луч находится на оси. Когда фокальное пятно центрировано на микроскопе, чип и перемещение объектива по оси Z не изменяется. Центральная точка расфокусировки луча рамена происходит при помещении образца в плоскость образца и облучении лазерным светом.

Дихроичный фильтр, помещенный под объективом микроскопа, отделяет смещенную волну. Рамен рассеивал свет от возбуждающего луча, направляя рамен рассеянный свет к боковому порту микроскопа. Микроскоп был модифицирован таким образом, чтобы удалить любые линзы в пределах этого пути, так что сигнальный свет выходит из микроскопа с покрытием, потому что сигнальный луч, выходящий из микроскопа, больше, чем чистая апертура железы.

Поляризаторы Томпсона, телескоп в 0,47 раза, сконструированный из двух ароматических дублетов, используются для уменьшения пучка. Затем сигнальный свет поляризуется поляризатором Томпсона, ориентированным на ноль градусов по отношению к вертикали в лабораторной раме, и направляется на дихроичное зеркало, где он рекомбинируется с пучком накачки. Луч накачки направляется в линию задержки, состоящую из двух зеркал, расположенных под прямым углом друг к другу, расположенных на линейном столике, который может быть настроен для обеспечения временного перекрытия импульсов накачки и сигнала.

После линии задержки луч направляется через промежуточную пластину и поляризатор, ориентированный под углом 45 градусов по отношению к вертикали в лабораторной раме. Это обеспечивает правильное поляризационное состояние луча накачки при достижении им нелинейной среды. Затем свет отражается от двух рулевых зеркал, одно из которых с пьезоэлектрическим управлением, которое должно использоваться для окончательной регулировки положения луча насоса таким образом, чтобы он пространственно перекрывался с сигнальным лучом.

Чтобы получить это перекрытие, наблюдайте за лучами насоса и сигнала в двух местах, одном близком и одном удаленном от дихроичного зеркала, где лучи объединяются, используя первое рулевое зеркало для перекрытия двух лучей в ближней точке и зеркало Пизо для перекрытия лучей в дальней точке, луч насоса может быть точно соотнесен с сигнальными лучами. Далее следует настроить гофрокартон и систему сбора таким образом, чтобы максимально увеличить собираемый по времени стробируемый сигнал. Для этого накачка и сигнальные лучи сначала пропускаются через фильтр diic с наружным диаметром 6 на 404 нанометрах, чтобы предотвратить возбуждение и рассеяние остаточного возбуждающего света в нелинейной среде.

Затем накачка и сигнальные лучи фокусируются с помощью ароматического дублета в кварцевую вету длиной в один сантиметр пути, содержащую нелинейный материал, может быть использован любой нелинейный материал, имеющий достаточно высокий нелинейный индекс и достаточно короткий временной отклик. Здесь. Для этих экспериментов мы используем дисульфид углерода. Затем свет повторно коллимируется вторым дублетом с фокусным расстоянием, идентичным первому.

Затем пучки пропускаются через анализатор Томпсона на вращающемся монтировании, а затем через набор поглощающих и интерференционных фильтров, которые в совокупности имеют внешний диаметр 10 на 808 нанометрах. Наконец, сигнальный свет фокусируется с помощью ароматического дублета в 50-микронное многомодовое оптическое волокно, где волокно монтируется в стол, позволяющий транслировать сигналы X, Y и Z. Затем волокно соединяется с коммерческим спектрографом изображения с подключенной ПЗС-камерой для выравнивания системы сбора данных для максимизации собранного сигнала. установите анализатор на нулевые градусы и поместите тестовый образец толуола в плоскость образца, оптимизируйте собранный сигнал комбинационного рассеяния света, отрегулировав элементы управления X, Y и Z оптоволоконного крепления для обеспечения надлежащего пространственного и временного перекрытия лучей насоса и сигнала. Поместите зеркало в плоскость образца микроскопа.

Затем извлеките из системы фильтр 404 нанометра. Поверните анализатор на 90 градусов так, чтобы отраженный от ретро луч 404 нанометра направлялся на спектрограф с отрегулированной интенсивностью таким образом, чтобы он не насыщал камеру. Теперь, когда луч насоса выключен, поверните анализатор, чтобы свести к минимуму передаваемый сигнал 404 нанометра.

Затем снова включите луч накачки и медленно регулируйте ступень задержки, пока пропускание света 404 нанометра не начнет увеличиваться. Затем итеративно поверните каскад задержки, пьезоэлектрическое зеркало и элементы управления X, y и Z волокна для максимизации сигнала, потому что ретроотраженный луч 404 нанометра и рассеянный свет комбинационного рассеяния могут идти немного разными путями через систему. Внесите окончательные корректировки, поместив мощный рамановский рассеиватель, такой как толуол, на предметный столик образца, заменив рамановский фильтр и немного изменив юстировку, изменив пизозеркало ступени задержки, а также элементы управления X, Y и Z волокна для оптимизации комбинационного сигнала.

Теперь система готова к сбору спектров. Для этого сначала требуется получить несколько фоновых кривых для коррекции системных артефактов. Во-первых, когда анализатор установлен на ноль градусов, луч возбуждения включается, а луч насоса выключается.

Получите необработанный спектр, затем установите анализатор на 90 градусов и соберите фоновый спектр, представляющий рассеянный свет, проходящий через поляризаторы. Далее, когда анализатор остается под углом 90 градусов, выключите луч рамена и включите луч накачки. Соберите второй фоновый спектр, представляющий количество света насоса, проходящего через дихроичные фильтры.

Наконец, когда все лазеры выключены, соберите базовый темновой спектр, представляющий уровень темнового тока камеры и электроники. Наконец, включите все лучи и соберите стробированный спектр. Чтобы получить истинный спектр только света, проходящего через затвор, два фоновых спектра и темный спектр должны быть вычтены из этого закрытого спектра.

Здесь мы видим принципиальную схему системы гофрирования. Траектория луча насоса отображается сплошной красной линией, а траектория SHG — сплошной темно-синей линией. Дорожка, на которой рамен и флуоресценция перекрываются, показана зеленым цветом.

В то время как путь, на котором флуоресценция была временно отфильтрована, отображается желтым цветом. Здесь мы видим сырые спектры кумарина, растворенного в иммерсионном масле. Красная кривая показывает спектр, полученный с открытым затвором, а черная кривая показывает спектр, полученный с анализатором, выровненным для минимальной передачи и приложенным пучком накачки.

Синяя кривая показывает спектр, полученный с анализатором, выровненным для минимального пропускания и без применения пучка насоса, а зеленая кривая показывает спектр, полученный с применением только луча насоса. Все спектры были гладкими с помощью 11-точечного фильтра KY третьего порядка. Пунктирными пурпурными линиями обозначена спектральная область, показанная на следующем графике.

Здесь мы видим спектры кумарина, растворенного в иммерсионном масле после вычитания флуоресцентного фона. Красная кривая — это спектр с открытыми воротами, а синяя кривая — это закрытый спектр. В стробированном спектре отчетливо прослеживается запутанное высокое волновое число, пиковая характеристика масел.

При попытке выполнить эту процедуру важно помнить, что лазер сначала должен иметь достаточную энергию импульса для управления ГА, и что системе требуется тщательное пространственное и временное перекрытие двух импульсов. После просмотра этого видео и прочтения прилагаемого протокола, у вас должно сложиться хорошее понимание того, как разделить лазерный луч на возбуждающий и кривой. Как перекрыть эти два луча, как пространственно, так и временно.

Как записать сигнал рамена с помощью спектрографа и C, c, D, а также как визуализировать и анализировать сигнал рамэна. Не забывайте, что работа с лазерами может быть чрезвычайно опасной, и при попытке этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение лазерных очков. Дополнительные правила безопасности применяются к использованию нелинейного материала и к использованию вашего конкретного образца.