1,5 час порядок идентификации Enterococcus Виды Непосредственно из культуры крови

Общая цель данной процедуры — быстрое определение видов enterococcus в положительных флаконах с гемокультурой с помощью флуоресцентной гибридизации на основе пептидных нуклеиновых кислот (PNA-FISH). После подготовки культур крови и проведения окраски по Грамму для подтверждения наличия культур Enterococci образцы фиксируют на предметных стеклах для PNA-FISH. Затем стекла инкубируют с PNA-зондами, специфичными для искомых организмов.

После гибридизации зондов проводят серию строгих промывок для удаления избытка негибридизованного зонда. На предметные стекла наносят среду для заключения, после чего их закрывают покровными стеклами. Виды enterococcus, присутствующие в образце, могут быть идентифицированы с помощью флуоресцентной микроскопии.

Данный протокол идентификации методом PNA FISH является уникальным, поскольку обеспечивает быстрый и специфичный способ идентификации энтерококков при сепсисе. Образцы культур крови пациента: две бутыли для культур крови (одну аэробную и одну анаэробную), содержащие венозную кровь пациента с подозрением на сепсис, инкубируют в автоматизированном приборе для культур крови при температуре 35 °C. Как только прибор укажет на обнаружение микробного роста, извлеките бутыль и аккуратно перемешайте её круговыми движениями для равномерного ресуспендирования бактерий.

Затем с помощью стерильного шприца и иглы асептически перенесите примерно 5 мл крови из каждого флакона в отдельную пробирку с завинчивающейся крышкой. После распределения всех образцов с помощью стерильной пипетки нанесите каплю крови из каждой пробирки на отдельный предметное стекло. Оставьте стекло высыхать на воздухе примерно на 15 минут.

После полного высыхания предметного стекла погрузите его в метанол для фиксации образца. После фиксации промойте стекла и проведите стандартное окрашивание по Граму, чтобы определить морфологию микроорганизмов, присутствующих в каждой культуре крови. Изучите окрашенные препараты с помощью микроскопа с масляным иммерсионным объективом.

Введенный вид кокков будет проявляться как грамположительные кокки, обычно собранные в пары или короткие цепочки. Поместите одну каплю фиксирующего раствора в лунку предметного стекла для микроскопа. Осторожно перемешайте пробирку с культурой крови, подлежащей исследованию.

Затем перенесите 10 µL культуры в каплю фиксирующего раствора и перемешайте содержимое с помощью дозатора, чтобы эмульгировать образец. Поместите предметные стекла на нагревательную пластину при 55 °C на 20 минут для фиксации мазков в каждом тесте. Обязательно включите в анализ предметные стекла с положительным и отрицательным контролем для оценки качества анализа.

Контрольные стекла с каллусом можно приобрести у Van DX или подготовить, используя референтные культуры. После подготовки мазка нанесите одну каплю EFI callous O-E-P-N-A в лунку с образцом культуры крови, а также в лунки с положительным и отрицательным контролем. Чтобы избежать загрязнения основного раствора зонда, следите за тем, чтобы кончик флакона-капельницы не касался мазка крови.

Накройте образец покровным стеклом, стараясь не допустить образования пузырьков воздуха. Затем инкубируйте предметное стекло на нагревательном блоке при 55 °C в течение 30 минут. Чтобы обеспечить гибридизацию PNA после инкубации, поместите предметные стекла в кассету.

Поместите заполненный держатель предметных стекол в кювету для окрашивания, содержащую предварительно нагретый до 55 °C промывочный раствор. Чтобы удалить излишки PNA из образца, аккуратно снимите покровное стекло, встряхивая предметное стекло в буфере или используя пинцет. Инкубируйте предметное стекло в промывочном растворе при температуре 55 °C в течение 30 минут.

Затем извлеките предметное стекло из ванночки для окрашивания и дайте ему высохнуть на воздухе. После высыхания стекла нанесите на него одну каплю смолы для заключения при комнатной температуре и осторожно накройте образец покровным стеклом. Исследуйте стекла с помощью флуоресцентного микроскопа с использованием двухполосного фильтра в течение двух часов после подготовки.

С помощью данного метода можно отличить iffy, callous, отмеченные зеленым слева, от eum, отмеченных красным. На средней панели в крайней правой части представлен отрицательный результат. Для достижения успешных результатов необходимо помнить о трех вещах: температура прибора должна поддерживаться на заданных значениях.

Необходимо строго соблюдать процедуру окрашивания, изложенную в инструкции по применению. Кроме того, интерпретацию препарата должен проводить опытный специалист, обеспечивающий тщательный анализ микропрепарата. Данный протокол полезен при принятии решений по тактике терапии сепсиса, вызванного enterococcus.

Благодарим за просмотр и желаем успехов в ваших экспериментах.