Всего монтажа иммуногистохимического анализа для Эмбриональные сосудистой кожи конечностей: модельная система для исследования сосудистой Ветвление Морфогенез в зародыше

Общая цель этой процедуры заключается в проведении иммуногистохимического анализа всего Маунта для визуализации всей сосудистой сети в развивающейся коже конечностей. Это достигается путем срезания четырех конечностей у эмбриона, фиксации четырех конечностей в 4% параформном альдегиде в PBS, а затем их обезвоживания в 100% метаноле. Второй шаг заключается в использовании тонкого пинцета для снятия кожи у основания конечности.

Следуйте синим пунктирным линиям и снимите кожуру в посуде, содержащей 100% метанол. Снимите кожу с конечности. Далее проводится иммуногистохимическое окрашивание сосудистыми специфическими первичными антителами и флуоресцентными вторичными антителами на коже конечностей.

Наконец, конфокальная микроскопия всего монта с множественным мечением обеспечит надежную визуализацию всей сосудистой сети кожи конечности, что может дать преимущество этой методике перед существующими методами, такими как перекрестный гистологический анализ. Использование срезов эмбрионов заключается в том, что иммуногистохимический анализ сосудистой сети кожи конечностей позволяет нам не только визуализировать всю сосудистую сеть, включая клеточные компоненты, но и изучить процессы дифференцировки и структурирования клеток кровеносных сосудов и ветвления лимфатических сосудов. Мы демонстрируем процедуру вместе с постдоком из моей лаборатории, Кожа эмбриональных конечностей собирается у беременных самок мышей.

После удаления и промывания матки поработайте под препарирующим микроскопом, чтобы отделить и препарировать эмбрионы. После того, как эмбрионы были препарированы, следующим шагом является удаление четырех LIMS из эмбрионов с помощью тонкого пинцета. Разрежьте четыре лимы на плече, затем с помощью кольцевых щипцов перенесите четыре лимы на 24-луночную пластину со льдом.

Холодный, свежий 4%Paraform Hyde в PBS поместите два четыре LIMS на лунку в два миллилитра 4%PFA. Зафиксируйте четыре конечности с помощью осторожного перемешивания на мутаторе-миксере при температуре четыре градуса Цельсия на ночь на следующий день. Удалите PFA из каждой лунки и добавьте два миллилитра PBS.

Промойте образцы в течение пяти минут, аккуратно перемешивая на смесителе-мутаторе при комнатной температуре. Повторите эту стирку дважды, всего три стирки. Далее переложите четыре конечности в пятимиллилитровую полипропиленовую трубку с круглым дном, содержащую 100% метанол, храните при температуре минус 20 градусов Цельсия в ферментной морозильной камере с критическим контролем температуры и без функции автоматического размораживания После ночного хранения и минус 20 кожа может быть содрана с падающих.

Это один из самых важных аспектов этой процедуры, потому что успех последующего окрашивания и визуализации зависит от того, не повредишь ли кожа. Кожа конечности легко отделяется от конечности при обезвоживании таким образом, чтобы отшелушить кожу от четырех конечностей. Сначала поместите конечность брюшной стороной вверх.

Затем с помощью тонкого пинцета рассеките кожу у основания конечности по направлению к лапе по прямой линии. Затем рассеките вокруг всей конечности, снимая кожу по мере поворота конечности. Как только кожица будет снята.

Четыре конечности начинают полностью иммуногистохимическое окрашивание кожи конечностей Подготовьте заранее. Три стоковые 50-миллилитровые тюбики с 75%, 50% и 25% метанолом в PBT для регидратации. Шкуры, шкуры конечностей регидратируются путем инкубации с помощью тертого ряда метанола от самой высокой до самой низкой концентрации метанола в течение пяти минут каждая.

Для начала переложите кожу конечности в пятимиллилитровую полипропиленовую трубку с круглым дном, содержащую 75% метанола в PBT. Через пять минут на смесителе-мутаторе осторожно отасуньте 75% метанол и снова заполните 50% метанола и PBT. Пять минут спустя.

Замените 50%-ный метанол на 25%-ный метанол и ПБТ. По окончанию финальная инкубация. Осторожно отсасывайте 25% метанол PBT и залейте PBT.

Промойте кожу конечностей в течение пяти минут, аккуратно перемешивая на миксоре-мутаторе при комнатной температуре. Повторите эту стирку один раз. Будьте осторожны, чтобы не повредить кожу конечностей во время обмена растворами.

После того, как кожа конечностей будет увлажнена, заблокируйте ее с помощью соответствующего блокирующего буфера. Выдерживайте в течение двух часов, аккуратно перемешивая на ореховом миксере при комнатной температуре Через два часа поместите шкурки конечностей на чашку Петри размером 35 на 10 миллиметров. Затем с помощью кольцевых щипцов перенесите кожу в двухмиллилитровую пробирку, содержащую 800 микролитров первичных антител, разведенных в соответствующем блокирующем буфере.

В этом случае можно одновременно использовать несколько первичных антител, полученных из разных видов. Инкубируйте шкурки конечностей с помощью осторожного перемешивания на мутаторе при четырех градусах Цельсия в течение ночи на следующий день, поместите шкурки конечностей на чашку Петри размером 35 на 10 миллиметров. Переложите шкурки в пятимиллилитровую полипропиленовую трубку с круглым дном, содержащую четыре литра соответствующего буфера для стирки.

Промыть пять раз по 15 минут каждый с аккуратным перемешиванием на мутаторе миксера при комнатной температуре. Осторожно заменяйте использованный буфер на новый буфер для каждой стирки во время стирки. Подготовьте вторичные антитела для удаления агрегированных частиц вторичных антител.

Используйте мембранный шприцевой фильтр PVDF 0,22 микрона, чтобы отфильтровать вторичный раствор антитела в 1,5-миллилитровую пробирку. Затем центрифугируйте отфильтрованный образец при 15 000 об/мин в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия для удаления частиц и пузырьков воздуха. Соберите отфильтрованный раствор антител в двухмиллилитровую микропробирку.

Когда пять промываний будут завершены, поместите кожу конечностей на чашку Петри размером 35 на 10 миллиметров и перенесите ее в двухлитровую микропробирку, содержащую 800 микролитров вторичных антител в блокирующем буфере. На этом этапе можно одновременно использовать различные флуоресцентные конъюгированные вторичные антитела, полученные из разных видов. Инкубируйте конечности, шкурки в темноте в течение одного часа с аккуратным перемешиванием на мутаторе миксера при комнатной температуре.

После часовой инкубации поместите шкурки конечностей в чашку Петри размером 35 на 10 миллиметров и переложите их в пятимиллилитровую полипропиленовую трубку с круглым дном, содержащую четыре миллилитра соответствующего промывочного буфера. Промыть пять раз по 15 минут каждый в темноте, аккуратно перемешивая на миксере Tator при комнатной температуре для визуализации с помощью конфокальной микроскопии. Шкуры конечностей должны быть установлены на предметное стекло после иммуногистохимического окрашивания.

Чтобы начать эту процедуру, поместите окрашенные шкуры конечностей на чашку Петри размером 35 на 10 миллиметров, работая под стереомикроскопом с низкой освещенностью. Чтобы избежать обширного фотоотбеливания, используйте тонкий пинцет для удаления кристаллов пыли и волокон с внутреннего слоя кожи. Перенесите кожу конечностей на адгезивное предметное стекло для микроскопии.

Поместите шкурки внутренним слоем вверх на предметное стекло лицом к покровному листу. Затем аккуратно разровняйте шкурки с помощью тонкого пинцета. Снимите переносной буфер для стирки салфеткой Кима.

Добавьте монтажный материал Antifa на кожухи и поместите крышку 25 на 25 поверх образцов. Следите за тем, чтобы не занести пузырьки воздуха на ровную поверхность в темноте при комнатной температуре для длительного хранения образцов. Приклейте чехол к предметному стеклу лаком для ногтей и храните при температуре четыре градуса Цельсия.

Структура нервов и кровеносных сосудов у мышей для кожи конечностей при E 15,5 показана этими репрезентативными результатами конфокальной иммунофлуоресцентной микроскопии с тройной меткой, иммунофлюоресценцией панэндотелиального клеточного маркера pcam one is blue. Маркер нейрофиламента два Н три имеет зеленый цвет, а маркер гладкомышечных клеток альфа СМА – красный. На этих изображениях был выявлен характерный характер ветвления альфа-положительных артерий, положительных на СМА, обозначенных белой стрелкой, выровненных с двумя Н-тремя периферическими нервами, обозначенными открытыми стрелками, в дополнение к разветвлению кровеносных сосудов.

Эта модель сосудистой сети кожи конечностей также может выявить паттерн ветвления лимфатических сосудов с использованием маркера лимфатических эндотелиальных клеток LYVE один показан красным цветом и нейротаблетка из двух показанных зеленым лимфатических сосудов визуализируются как LYV один, так и NRP два, в то время как LYV one также экспрессируется подмножеством макрофагов, обозначенных открытыми стрелками. Этот метод открывает исследователям в области сосудистой биологии путь к изучению сложных структур и процессов дифференцировки сосудистой сети во время развития тканей, восстановления тканей и при заболеваниях.