В Vivo собак Пробирной функции мышц

Общая цель данной процедуры — измерение и характеристика механических свойств мышц задних конечностей живой собаки с использованием неинвазивных методов. Для этого сначала собаку правильно фиксируют в физиологической установке. Вторым этапом процедуры является измерение и запись изометрического крутящего момента при одиночном сокращении и максимального крутящего момента при сгибании голеностопного сустава.

Третьим этапом процедуры является выполнение эксцентрических сокращений. Заключительным этапом процедуры является измерение и запись изометрического подергивания, крутящего момента и тонического крутящего момента при разгибании голеностопного сустава. В конечном итоге с помощью этого неинвазивного физиологического метода можно получить данные, демонстрирующие силу мышц задних конечностей и их реакцию на повторяющиеся эксцентрические сокращения.

Основное преимущество этого метода перед существующими подходами, такими как анализ изолированных мышц ex vivo, которые являются терминальными исследованиями, заключается в том, что данный метод может повторяться в динамике, поскольку он неинвазивен и хорошо переносится. Этот подход позволяет ответить на ключевые вопросы в области физиологии мышц, например, о реакции мышц на повреждение, вызванное сокращением, или на утомление. Применение данной техники распространяется на терапию или диагностику мышечных дистрофий, так как этот метод позволяет оценивать функцию мышц у собак и других крупных млекопитающих.

Использование таких крупных животных необходимо в доклинических исследованиях многих новых методов терапии перед началом клинических испытаний с участием пациентов. Хотя данный метод позволяет получить ценные сведения на моделях собак, его также можно применять к другим модемным системам животных, таким как нечеловекообразные приматы. Как правило, специалисты, впервые осваивающие этот метод, сталкиваются с трудностями из-за необходимости тщательного размещения стимулирующих электродов, а также из-за недостатка знаний о том, какие результаты следует ожидать при регистрации кривых крутящего момента. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку этапы позиционирования электродов трудно освоить из-за точности, необходимой для достижения максимального отклика крутящего момента от мышц.

В рамках исследования используются два протокола, разработанных в программном обеспечении Dynamic Muscle Control (DMC), для определения параметров стимуляции и регистрации данных. Первый протокол, протокол изометрического сокращения, применяется как для единичных сокращений (twitch), так и для тетанических сокращений. Второй протокол, называемый протоколом эксцентрического растяжения (eccentric stretch injury), используется для эксцентрических сокращений; настройки стимулятора и последовательности команд ПО для каждого протокола приведены в представленной таблице. Единичные сокращения вызываются стимуляцией с частотой 1 Hz.

Тетанические и эксцентрические сокращения вызываются стимуляцией с частотой 50 Гц. В случае эксцентрического сокращения на сокращающуюся мышцу накладывается растяжение. Эти эксперименты включают вызов нескольких типов мышечных сокращений: стимуляцию малоберцового нерва для вызова одиночного, тетанического или эксцентрического сокращений сгибателя, а также стимуляцию большеберцового нерва для вызова одиночного или тетанического сокращений разгибателя.

После введения собаке анестетика проверьте мигательный рефлекс, чтобы убедиться, что животное находится в состоянии глубокого наркоза. Тщательно контролируйте уровень углекислого газа, показатели пульсоксиметрии и температуру. В ходе процедуры выбрейте шерсть на латеральной поверхности коленного сустава в месте размещения стимулирующих электродов.

Затем поместите собаку на физиологический стол. Расположите тазовую конечность в положении лежа на спине таким образом, чтобы бедренная и большеберцовая кости образовывали прямой угол, а большеберцовая кость была параллельна поверхности стола; убедитесь, что педаль датчика силы может безопасно вращаться. При перемещении вручную она должна ощущаться жесткой.

Затем включите физиологическую установку и активируйте педаль. Движение педали управляется сервомотором, который, в свою очередь, контролируется компьютером. Теперь осторожно поместите лапу собаки на ножную педаль, измерьте и зафиксируйте длину лапы собаки от центральной оси вращения до конца латерального пальца.

Затем зафиксируйте лапу собаки в педали с помощью эластичного самоклеящегося бинта. Датчик в педали регистрирует силу сокращения мышц конечности. Подготовьте стимулирующие электроды, подключив экранированные однополярные электроды калибра 24 gauge к блоку изоляции стимулов.

Надев перчатки, очистите кожу собаки спиртом и путем пальпации найдите общий малоберцовый нерв чуть дистальнее латерального проксимального отдела малоберцовой кости, отметив пальцем область расположения нерва; осторожно введите черный катодный электрод под кожу, а красный анодный электрод разместите под кожей параллельно и чуть дистальнее катодного электрода, непосредственно над надкостницей. Оба электрода теперь должны находиться внутреннее общего малоберцового нерва, чуть дистальнее головки малоберцовой кости. Затем активируйте стимулятор с частотой 1 Гц и наблюдайте за ответным сокращением (twitch response) на мониторе.

При необходимости внесите небольшие коррективы в положение электродов, чтобы добиться максимально возможной амплитуды сокращения. После того как электроды будут правильно размещены, активируйте программное обеспечение DMC для регистрации сократительного ответа. Следующий шаг — вызвать тетаническое сокращение, не перемещая электроды.

Настройте стимулятор в соответствии с таблицей для достижения титанического сокращения. Затем активируйте в программном обеспечении протокол изометрического сокращения, чтобы вызвать изометрическое титаническое сокращение мышцы. Следующий эксперимент — протокол повреждения при эксцентрическом растяжении — также проводится без перемещения электродов.

Настройте стимулятор для эксцентрического сокращения и начните стимуляцию. В данном протоколе нерв стимулируется 10 раз с частотой 50 hertz в течение одной секунды. В течение этой одной секунды мышцы-сгибатели сокращаются изометрически в первые 800 milliseconds, после чего мышца растягивается в течение последних 200 milliseconds.

После одной серии из 10 эксцентрических сокращений дайте мышце отдохнуть в течение четырех минут. Затем повторите протокол нанесения травмы путем эксцентрического растяжения еще дважды с четырехминутным перерывом между сериями. Чтобы стимулировать мышцу-разгибатель, переместите электроды на большеберцовый нерв, введя их перпендикулярно коже проксимальнее места первоначального расположения электродов, использованного для сгибания. Ориентировочная точка установки находится вдоль линии, которая делит пополам угол в 90 градусов, образованный коленом.

Большеберцовый нерв расположен глубже и медиальнее общего малоберцового нерва. Перемещайте электроды по мере необходимости для получения оптимальных потенциалов сокращения. После размещения электродов вызовите максимальное сокращение, используя изометрический протокол, не перемещая электроды.

Измените настройки стимулятора в соответствии со спецификациями для тетанических сокращений. Затем активируйте и зарегистрируйте тетаническое сокращение большеберцовой мышцы-разгибателя пальцев стопы. Для анализа крутящего момента и временных характеристик мышечных сокращений используется программа динамического анализа мышц (DMA).

На этом рисунке стимуляция большеберцового нерва с частотой 1 Гц вызывала одиночные сокращения мышц-разгибателей предплюсны большеберцового нерва; для анализа данных положения трех курсоров установлены следующим образом. Синий курсор установлен в точке, где крутящий момент начинает расти от уровня покоя. Желтый курсор расположен в точке, где крутящий момент возвращается к уровню покоя.

После фазы релаксации белый курсор становится ненужным, поэтому он перемещается вправо от желтого курсора. На данном рисунке показано, что изометрическая стимуляция большеберцового нерва пачкой из 50 Гц импульсов продолжительностью 1,5 секунды привела к тетаническому сокращению мышцы-разгибателя предплюсны. Для анализа данных устанавливаются синий и желтый курсоры.

Что касается анализа сократительного отклика на данном рисунке, эксцентрические сокращения индуцировали в большеберцовых сгибателях предплюсны. Перкутанная стимуляция промежностного нерва активировала начальное изометрическое сокращение продолжительностью 800 миллисекунд, после чего к конечности применяли принудительное растяжение. При анализе этих данных синий курсор расположен в точке, где изометрический крутящий момент начинает расти относительно момента покоя.

Желтый курсор устанавливается в точке, где эксцентрический крутящий момент растяжения начинает расти от изометрического плато. Белый курсор устанавливается там, где момент возвращается к моменту покоя. При должном исполнении эта техника после освоения может быть выполнена примерно за один час. При выполнении данной процедуры важно использовать распечатанный протокол с пошаговым контролем выполнения.

Для получения ответов на дополнительные вопросы, такие как тип мышечных волокон или экспрессия трансгена после его разработки, могут быть использованы другие методы, например, биопсия мышц. Данная методика открыла перед исследователями в области физиологии мышц возможности изучения реакций на физическую нагрузку у собак с мышечной дистрофией. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как проводить неинвазивный анализ физиологии мышц у собак.