Изображений С. Элеганс Эмбрионы использованием Epifluorescent Микроскоп и открытое программное обеспечение
24 марта 2011 г.
С. Элеганс Эмбрион представляет собой мощную систему для изучения клеточной биологии и развития. Мы представляем протокол для живых изображений С. Элеганс Эмбрионов использования DIC оптике или флуоресценции с помощью доступной epifluorescent микроскопы и с открытым исходным кодом.
В данном протоколе демонстрируется способ визуализации динамических событий в эмбрионах C. elegans на ранних стадиях с использованием оптики Norky DIC или флуоресценции с помощью широкодоступных микроскопов и программного обеспечения с открытым исходным кодом. Протокол начинается с описания того, как препарировать эмбрионы C. elegans и монтировать их для получения изображений. Затем рассматривается правильная настройка оптики DIC Norky для обеспечения оптимального качества изображений с максимальной детализацией.
Также рассматривается калибровка широкопольного эпифлуоресцентного освещения для получения качественных флуоресцентных изображений с использованием программного обеспечения с открытым исходным кодом. Качественная микроскопия позволяет визуализировать клеточную динамику в развивающемся эмбрионе. Визуальные иллюстрации данного метода имеют решающее значение, так как правильная настройка оптики DIC затруднена из-за неоднозначности терминологии и сложности описания надлежащей техники в письменной форме.
Кроме того, исследователям следует стремиться максимально ограничить воздействие света при проведении флуоресцентной визуализации. Чтобы минимизировать фототоксичность и фотообесцвечивание, для подготовки эмбрионов к визуализации сначала приготовьте два фиксирующих раствора. Один из них — расплавленный вазелин, другой — 2–3% раствор agarose в буфере.
Для визуализации очень хрупких структур можно приготовить более плотный агар, стараясь при этом не допустить кипения. Оба стоковых раствора расплавляют в микроволновой печи, после чего разделяют на аликвоты по четыре-пять миллилитров для хранения. В день проведения визуализации расплавьте одну аликвоту раствора вазелина в термоблоке при температуре 65–70 °C и одну аликвоту раствора агара в микроволновой печи.
Опять же, избегайте кипения. Затем, чтобы поддерживать эти растворы в расплавленном состоянии, храните их в термоблоке. Далее наклейте полоску лабораторной ленты на верхнюю и нижнюю части двух предметных стекол и поместите чистое предметное стекло между двумя стеклами с лентой.
Теперь нанесите несколько капель расплавленного agarose на чистый предметное стекло и накройте его другим чистым стеклом. Agarose растекается в тонкий квадратный слой, формируя подложку для червей. С помощью диссекционного микроскопа и платиновой иглы перенесите двух взрослых червей в каплю буфера объемом от 9 до 12 µL на покровное стекло размером 18 × 18 мм.
Затем произведите разрез. Аккуратно вскройте червей с помощью иглы или скальпеля, чтобы высвободить эмбрионы, при этом образец должен лежать стороной с агаром вниз. Поместите подушечку с червями на покровное стекло размером 18 by 18 миллиметров и удалите излишки агара с помощью лезвия.
Наконец, чтобы закрепить покровное стекло, нанесите расплавленный раствор вазелина по его периметру с помощью кисти или зубочистки. Теперь клетки готовы к визуализации. При установке препарата на микроскоп убедитесь, что два поляризатора расположены перпендикулярно друг другу.
Убедитесь, что и диафрагмы, и призмы выведены из светового пути. Если поле зрения не темное, вращайте поляризатор под конденсором до достижения темноты. Найдите эмбрионы, используя объектив с 10-кратным увеличением.
Найдите рядом с телами червей группы молодых эмбрионов, чтобы в поле зрения попало несколько объектов. Для получения наилучших изображений избегайте эмбрионов, находящихся внутри червя. После того как наиболее подходящие эмбрионы будут найдены, переключитесь на объектив с бóльшим увеличением.
Теперь переключите блок фильтров в режим DIC. Далее введите верхнюю призму Уолстона объектива в путь светового луча и поверните револьвер конденсатора, чтобы выбрать нижнюю призму Уолстона, соответствующую объективу. После установки призм отрегулируйте ползунок под этим револьвером в соответствии с числовой апертурой линзы.
Для получения оптимального освещения по Кёлеру фокусируйте конденсор до тех пор, пока край диафрагмы конденсора не станет максимально четким. Максимальная четкость достигается тогда, когда граница между светлой и темной областями становится наиболее резкой или сфокусированной. Чтобы добиться оптимального контраста, отрегулируйте положение апертурной диафрагмы и призмы, вращая ручку на слайдере.
Теперь микроскоп почти готов к работе. Пришло время настроить дополнительные параметры визуализации на компьютере с помощью MicroManager и программного обеспечения с открытым исходным кодом. Начните с установки усиления камеры на ноль.
Затем переключите режим сохранения файлов на 8-битные TIFF, а не 16-битные. Файлы TIFF в дальнейшем можно анализировать с помощью бесплатного программного обеспечения с открытым исходным кодом, такого как Image J. Далее отрегулируйте уровень освещенности так, чтобы самые яркие пиксели находились чуть ниже уровня насыщения. Если все сделано правильно, изображение будет выглядеть объемным, как если бы свет падал под углом.
Когда изображение станет четким, выберите эмбрионы, которые вы хотите визуализировать, и выделите область интереса. Если микроскоп оснащен мотором фокусировки, используйте его для сбора данных в нескольких фокальных плоскостях в каждый момент времени. Откройте окно многомерного сбора данных и установите верхнюю и нижнюю границы Z-стека, вращая ручку фокусировки, чтобы найти первую и последнюю фокальные плоскости, в которых видны отдельные гранулы желтка.
Установите размер шага. Это определит количество собираемых фокальных плоскостей. Теперь установите временной интервал, достаточный для получения всех фокальных плоскостей.
Максимальное количество временных точек можно установить на очень высоком уровне, чтобы программное обеспечение продолжало делать снимки до ручной остановки. Настройте программу так, чтобы отображалось только последнее полученное изображение для мониторинга процесса. Теперь присвойте файлам изображений имя и начните захват изображений.
Анализ изображений будет кратко рассмотрен в конце следующего раздела. Создание видеозаписи GFP очень похоже на получение четырех D или Musky DIC, однако используется конфигурационный файл, включающий программное управление флуоресцентным затвором. После размещения эмбрионов убедитесь, что верхняя призма Уолстона находится вне светового пути, и переключите фильтр-куб на F-I-T-C-G-F-P.
Если этот параметр не был установлен автоматически при запуске программного обеспечения, убедитесь, что усиление камеры установлено на 255. Для файла изображения выбран 16-битный формат tiff. Теперь выключите источник проходящего света и нажмите «live imaging».
Отрегулируйте интенсивность источника УФ-излучения и время экспозиции для достижения оптимального соотношения сигнал/шум флуоресцентного сигнала, при этом поддерживайте воздействие света на минимальном уровне для сохранения жизнеспособности клеток. Затем установите временной интервал. Определите количество временных точек и количество фокальных плоскостей, после чего приступите к сбору изображений, как описано ранее.
Для анализа видеозаписей используйте программное обеспечение с открытым исходным кодом. Программу Image J с установленным плагином Micromanager. Очень большие видеофайлы также могут быть импортированы в Image J с помощью плагина Loci. На данном примере представлен эмбрион дикого типа, снятый с использованием нор-маски (nor masky) и оптики DIC.
Задняя сторона находится справа внизу, брюшная — слева внизу. В видео представлена последовательность изображений в одной фокальной плоскости, полученных каждые 15 секунд. Скорость воспроизведения установлена на уровне 14 кадров в секунду.
Этот эмбрион проявляет флуоресценцию во время первого дробления; задний полюс расположен в верхней правой части. В данном видео показаны изменения в одной фокальной плоскости с интервалом в 10 секунд. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как проводить визуализацию живых эмбрионов с использованием как оптики DIC Naski, так и эпифлуоресценции для изучения динамических процессов.
Мы надеемся, что теперь вы лучше понимаете, как настроить оптику DIC Nomar для получения оптимальных изображений, и осознаете, что высококачественные данные флуоресценции можно получить с помощью эпифлуоресцентного освещения, и не всегда есть необходимость в более совершенных микроскопах. Вы также можете применять эти методы визуализации для изучения эмбрионов с отсутствием функции специфических генов, чтобы глубже исследовать генетические требования к интересующим вас процессам в ходе клеточного деления или развития.
Обзор
В данном протоколе демонстрируется визуализация живых эмбрионов C. elegans с использованием дифференциально-интерференционного контраста (DIC) или флуоресценции. В нем представлены подробные этапы подготовки эмбрионов и оптимизации методов визуализации.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Клеточная биология
- Биология развития
- Методы микроскопии
Теоретические основы
- Эмбрионы C. elegans представляют собой модельную систему для изучения клеточной динамики.
- Методы визуализации живых объектов необходимы для наблюдения за процессами развития.
- Правильная настройка оборудования для визуализации имеет решающее значение для получения высококачественных результатов.
- Минимизация воздействия света важна для предотвращения фототоксичности.
Цель исследования
- Предоставить подробный протокол визуализации эмбрионов C. elegans.
- Углубить понимание клеточной динамики в ходе раннего развития.
- Использовать доступные инструменты микроскопии и программное обеспечение с открытым исходным кодом.
Используемые методы
- Диссекция и монтаж эмбрионов C. elegans.
- Калибровка оптики дифференциально-интерференционного контраста (DIC) и настроек флуоресценции.
- Использование программного обеспечения с открытым исходным кодом для получения и анализа изображений.
- Оптимизация параметров визуализации для получения высококачественных изображений.
Основные результаты
- Успешная визуализация динамических процессов в эмбрионах C. elegans.
- Обоснована важность правильной настройки оптической системы для достижения четкости изображения.
- Предложены рекомендации по минимизации светового воздействия во время визуализации.
- Обеспечен сбор многомерных данных изображений.
Выводы
- Данный протокол обеспечивает эффективную визуализацию эмбрионов C. elegans.
- Правильная техника и настройка оборудования имеют решающее значение для успешного получения изображений.
- Использование программного обеспечения с открытым исходным кодом делает метод более доступным для исследователей.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Визуализация эмбрионов C. elegans в режиме реального времени позволяет детально изучить механизмы таких клеточных процессов, как сборка хромосом и цитокинез, что обеспечивает прогностическую уверенность при валидации мишеней в рамках программ раннего поиска. В данном протоколе используются доступные методы микроскопии и программное обеспечение с открытым исходным кодом для проведения масштабируемого и воспроизводимого фенотипического скрининга в релевантной для заболеваний системе с известными линиями развития и генетической доступностью.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы посредством прямой визуализации динамических клеточных событий in vivo.
- Операционная ценность: способствует снижению биологических рисков путем уточнения функций генов в путях развития с использованием флуоресцентных репортеров или дифференциально-интерференционного контраста (DIC).
- Прогностическая ценность: облегчает идентификацию перспективных соединений-лидеров, связывая генетические пертурбации с фенотипическими результатами в высокоточной эмбриональной модели.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: Подготовка валидированных биологических систем для последующей оценки соединений с использованием стандартизированных рабочих процессов монтирования и визуализации эмбрионов.
- Количественные результаты: Обеспечение таймлапс-регистрации Z-стеков и многомерных данных для воспроизводимого измерения клеточной динамики.
- Повторное использование платформы: Использование широкодоступных эпифлуоресцентных микроскопов и программного обеспечения с открытым исходным кодом для снижения зависимости от специализированной инфраструктуры визуализации.
Трансляционные и доклинические исследования
- Значимость для изучения заболеваний: связывает фундаментальные клеточные механизмы с фенотипами развития с потенциалом согласования трансляционных биомаркеров.
- Преклиническая преемственность: поддерживает принятие решений о продвижении проекта с учетом рисков, предоставляя динамические данные с разрешением по линиям клеток на основе исследований генетических пертурбаций.
- Механистическое снижение рисков: уменьшает неопределенность при валидации мишеней путем наблюдения в реальном времени за последствиями нокдауна генов или мутаций в процессе эмбриогенеза.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод интегрируется в рабочие процессы раннего поиска путем обеспечения возможности проверки гипотез, уточнения сигнальных путей и фенотипического скрининга до этапов оптимизации ведущих соединений.
- Открывающая биология: поддержка проверки гипотез и снижения биологических рисков посредством прижизненной визуализации делений эмбриональных клеток и процессов развития.
- Скрининг: обеспечение стандартизации и воспроизводимости анализа за счет контролируемого закрепления эмбрионов, калибровки освещения и использования открытого программного обеспечения для сбора данных.
- Аналитика: получение количественных показателей, таких как интенсивность флуоресценции, морфология ядер и время цитокинеза, для сравнительного анализа условий.
- Трансляционные исследования: соответствие задачам доклинической валидации путем установления связи между эмбриональными фенотипами и генетическими нарушениями, имеющими значение для моделей заболеваний человека.
- Корпоративное повторное использование: создание возможности многократного использования методов визуализации в различных проектах, изучающих консервативные клеточные механизмы на генетически доступных моделях.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает прогностическую уверенность в валидации мишеней за счет снижения механистической неопределенности в регуляции клеточных процессов.
- Операционная ценность: Повышает воспроизводимость и масштабируемость благодаря стандартизированным протоколам и совместимости с программным обеспечением с открытым исходным кодом.
- Стратегическая ценность: Оптимизирует принятие решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go), предоставляя ранние фенотипические данные in vivo, что снижает биологические риски на поздних этапах.
- Влияние на портфель: Позволяет проводить приоритизацию мишеней с учетом рисков на основе степени тяжести и экспрессивности фенотипа в процессе эмбрионального развития.
Особенности внедрения
- Требуется опыт работы с C. elegans, навыками препарирования эмбрионов и методами их фиксации на предметном стекле.
- Необходим исправный эпифлуоресцентный микроскоп с дифференциально-интерференционным контрастом (DIC), набором фильтров и моторным приводом фокусировки для получения Z-стеков.
- Требуется стандартизация уровней освещения, времени экспозиции и процесса приготовления фиксирующего раствора для всех пользователей.
- Необходимо учитывать особенности адаптации протокола для различных генетических линий или мутантных штаммов, влияющих на жизнеспособность или морфологию эмбрионов.
- Существуют практические ограничения, такие как риск фототоксичности при флуоресцентной визуализации и смещение эмбрионов при длительном сборе данных.
