Изображений С. Элеганс Эмбрионы использованием Epifluorescent Микроскоп и открытое программное обеспечение

Этот протокол демонстрирует, как визуализировать динамические события в эмбрионах на ранних стадиях CL egan с помощью оптики Norky DIC или флуоресценции с использованием широко доступных микроскопов и программного обеспечения с открытым исходным кодом. Протокол начинается с описания того, как препарировать эмбрионы CL gans и монтировать их для визуализации. Затем проверяется правильная настройка DIC или маскирующей оптики, чтобы обеспечить оптимальные изображения с максимальной детализацией.

Калибровка широкоугольной эпифлуоресцентной лампы и освещения также рассматривается для сбора качественных флуоресцентных изображений в сочетании с программным обеспечением с открытым исходным кодом. Хорошая микроскопия может визуализировать клеточную динамику в развивающемся эмбрионе. Визуальные иллюстрации этого метода имеют решающее значение, так как правильная настройка оптики D iic является сложной задачей, поскольку терминология может быть запутанной, а правильную технику трудно описать в письменной форме.

Кроме того, исследователи должны быть осторожны, чтобы свести к минимуму воздействие света при выполнении флуоресцентной визуализации. Чтобы ограничить фототоксичность и фотообесцвечивание Чтобы подготовить эмбрионы к визуализации, сначала сделайте два монтажных раствора. Один из них представляет собой расплавленный вазелин, а другой - от двух до 3% ароса в буфере.

Более плотные арос могут быть сделаны, если структуры, которые необходимо изобразить, очень хрупкие, стараясь не закипать. Оба исходных раствора расплавляют в микроволновой печи, а затем хранят в виде четырех-пяти миллилитровых аликвот. В день визуализации растопите аликвоту раствора вазелина в термоблоке при температуре от 65 до 70 градусов Цельсия и растопите одну аликвоту возникшего раствора в микроволновой печи.

Опять же, не допуская кипячения. Затем, чтобы сохранить эти растворы расплавленными, храните их в тепловом блоке. Затем накройте верхнюю и нижнюю части двух слайдов полоской лабораторного скотча и поместите чистый предметный стеклак между двумя скотчанными слайдами.

Теперь нанесите несколько капель расплавленного стекла на чистое предметное стекло и накройте его другим чистым предметным стеклом. Арос выкладывается на тонкую квадратную подушечку с подготовленной червячной подушечкой. Используйте препарирующий эндоскоп и платиновую проволоку, чтобы перенести двух взрослых червей в каплю буфера объемом от 9 до 12 микролитров на покровном листе размером 18 на 18 миллиметров.

Затем разрезать. Вспаруйте червей с помощью иглы или скальпеля, чтобы выпустить эмбрионы агарро стороной вниз. Поместите червячную подушечку на крышку размером 18 на 18 миллиметров и уберите все нависающие агары.

Наконец, чтобы запечатать покровное стекло, нанесите расплавленный раствор вазелина по его периметру с помощью малярной кисти или зубочистки. Теперь клетки готовы к визуализации. При помещении предметного стекла в микроскоп убедитесь, что два поляризатора выровнены перпендикулярно друг другу.

Убедитесь, что и стены, и призмы находятся вне светового пути. Если поле не темное, поверните поляризатор ниже конденсатора до тех пор, пока он не станет темным. Найдите эмбрионы, используя цель 10 раз.

Ищите рядом с телами червей группы молодых эмбрионов, чтобы получить несколько эмбрионов в поле визуализации. Избегайте эмбрионов внутри червя для получения наилучших изображений. Когда лучшие эмбрионы найдены, переключитесь на более высокую мощность.

Теперь переключите кубик фильтра на DIC. Затем вставьте верхнюю призму Walstone объектива в световой путь и поверните тарту на конденсоре, чтобы выбрать нижнюю призму Walstone, которая соответствует объективу. Установив призмы, отрегулируйте ползунок под этой револьверной головкой в соответствии с числовой апертурой объектива.

Чтобы получить оптимальную подсветку Колера, фокусируйте конденсор до тех пор, пока край диафрагмы конденсатора не станет самым резким. Самая резкая — это когда граница между светло-черным цветом наиболее четкая или в фокусе. Чтобы получить оптимальный контраст, отрегулируйте стенку и призму яблока, вращая ручку на ползунке.

Теперь микроскоп практически готов к использованию. Пришло время управлять дополнительными параметрами визуализации на компьютере с помощью микроменеджера и программного обеспечения с открытым исходным кодом. Начните с установки усиления камеры на ноль.

Затем переключитесь на сохранение файлов в формате 8 бит, а не 16 бит. Файлы TIFF позже могут быть проанализированы программным обеспечением с открытым исходным кодом, таким как Image J. Затем отрегулируйте уровень освещенности так, чтобы самые яркие пиксели находились чуть ниже уровня насыщенности. Если все было сделано правильно, изображение будет выглядеть как 3D, а свет будет светить под углом.

Теперь, когда изображение выглядит блестяще, выберите эмбрионы, которые вы хотите изобразить, и нарисуйте область интереса. Если микроскоп оснащен мотором фокусировки, используйте его для одновременного сбора нескольких фокальных плоскостей. Точка, откройте многомерное окно сбора данных и установите верхнюю и нижнюю плоскости стека Z, отрегулировав ручку фокусировки, чтобы найти первую и последнюю фокальную плоскость с некоторыми гранулами ярма в фокусе.

Установите размер шага. Это определит количество собираемых фокальных плоскостей. Теперь установите интервал времени, достаточный для захвата всех фокальных плоскостей.

Максимальные временные точки могут быть установлены очень высоко, чтобы программное обеспечение делало снимки до тех пор, пока оно не будет остановлено вручную. Настройте программное обеспечение на отображение только последнего полученного изображения, чтобы можно было контролировать процесс. Теперь присвойте изображениям имя файла и начните получать изображения.

Анализ изображений будет кратко рассмотрен в конце следующего раздела. Создание GFP-фильма во многом похоже на создание четырех D или Musky DIC, но используется конфигурационный файл, который включает в себя программное управление флуоресцентным разрушением. Вместо этого, установив эмбрионы, убедитесь, что верхняя призма Уолстоуна не находится на пути света, и переключите фильтрующий куб в положение F-I-T-C-G-F-P.

Если это значение не было автоматически установлено При запуске с помощью программного обеспечения, убедитесь, что усиление камеры установлено на 255. Для файла изображения устанавливается 16-битный формат tiff. Теперь выключите передаваемый источник света и нажмите кнопку «Изображение в реальном времени».

Отрегулируйте интенсивность источника ультрафиолетового света и время экспозиции, чтобы добиться хорошего соотношения сигнал/шум для сигнала флуоресценции, однако сведите воздействие света к минимуму, чтобы сохранить клетки. Далее задайте временной интервал. Количество временных точек и количество фокальных плоскостей теперь переходят к получению изображения, как описано ранее.

Для анализа фильмов используйте программное обеспечение с открытым исходным кодом. Изображение J с установленным плагином микроменеджера Очень большие фильмы также можно импортировать в изображение J с помощью плагина loci. Это эмбрион дикого типа, снятый с помощью немаскированной оптики DIC.

Задний находится внизу справа, а вентральный - внизу слева. В фильме показана последовательность изображений в одной фокальной плоскости, собираемых каждые 15 секунд. Воспроизведение установлено на уровне 14 кадров в секунду.

Этот зародыш проявляет флуоресценцию во время первого деления эмбриона, здесь сзади вверху справа. В этом фильме каждые 10 секунд показаны изменения в одной фокальной плоскости. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как визуализировать живые эмбрионы с помощью оптики DIC Naski и эпифлуоресценции для изучения динамических событий.

Мы надеемся, что вы лучше понимаете, как настроить оптику DIC Nomar для получения оптимальных изображений, и осознаете, что вы можете получить высококачественные флуоресцентные данные, используя эпифлуоресцентное освещение, и не всегда зависите от более совершенных микроскопов. Вы также можете применять эти методы визуализации для изучения эмбрионов, лишенных определенной функции генов, чтобы дополнительно исследовать генетические требования к вашим любимым событиям во время деления или развития клеток.