Исследование конформационной динамики мембранных белков На месте С Сайт-направленный флуоресцентная маркировка

Общая цель данной процедуры заключается в изучении конформационной динамики мембранных белков с использованием сайт-специфического флуоресцентного мечения на поверхности одиночных клеток. Это достигается путем предварительного индивидуального мутирования остатков на границе внеклеточного и трансмембранного доменов в цистеин, что обозначено красной буквой C. Затем необходимо определить, может ли данный остаток быть помечен флуорофором, реагирующим с цистеином. Вторым этапом процедуры является проверка того, влияют ли мутагенез по цистеину и/или мечение флуорофором на кинетику и/или конформационное состояние белка.

Это выполняется с использованием показанной установки. Третий этап процедуры заключается в сопоставлении изменений интенсивности флуоресценции с кинетическими параметрами целевого белка. Здесь показан типичный график флуоресценции.

Заключительным этапом процедуры является мечение мутантных пар цистеинов либо донорными флуорофорами, либо парами донор-акцептор для измерения скорости фотодеструкции одновременно с измерениями методом фиксации потенциала с целью определения ограничений по расстоянию. На данном рисунке скорость фотодеструкции донора в отсутствие акцептора показана черным цветом, а в присутствии акцептора — красным. В конечном итоге можно получить результаты, демонстрирующие, что изменения интенсивности флуоресценции, вызванные конформационными изменениями белка, могут быть соотнесены с функцией мембранного белка с помощью флуорометрии при фиксации потенциала.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области мембранного ионного транспорта, например, о том, как изменения конформационного состояния белка способствуют транспорту малых молекул и ионов через плазматическую мембрану. Начните процедуру с клонирования натрий-калиевого насоса в вектор, подходящий для экспрессии в ооцитах Xenopus laevis. Следующим шагом является введение мутаций цистеина в остатках, расположенных на границе раздела между трансмембранным и внеклеточным доменами, как описано в accompanying article.

По завершении подтвердите вставку мутации с помощью секвенирования ДНК после транскрипции плазмидной ДНК в мРНК, как описано в сопроводительной статье, и количественно определите выход мРНК с помощью спектрофотометра перед началом операции. Лягушку следует оставить голодать в течение 12 часов, чтобы предотвратить рвоту во время операции. Чтобы начать операцию на следующий день, погрузите лягушку в раствор анестетика до тех пор, пока она не перестанет реагировать на защемление пальца ноги.

Извлеките лягушку из анестезирующего раствора и поместите ее спиной вниз на впитывающую сторону одноразовой пеленки. Накройте лягушку влажным бумажным полотенцем, чтобы предотвратить пересыхание. Если глаза лягушки открыты, поддерживайте их увлажненными с помощью физиологического раствора.

Сделайте небольшой разрез в области средней линии с одной стороны тела лягушки. Найдите яичник и аккуратно выведите его наружу. Старайтесь, чтобы яичник не соприкасался с кожей.

Удалите яичник и поместите его в чашку Петри с раствором Рингера. Перед тем как вернуть оставшиеся ткани обратно в брюшную полость, проверьте, нет ли кровотечения. При возникновении кровотечения оказывайте давление стерильной ватной палочкой до его прекращения.

Завершите операцию, зашив разрез прерывистыми швами. С помощью ножниц верните лягушку в контейнер для восстановления после наркоза. Разделите изолированную долю яичника на более мелкие части.

Перенесите комочки в раствор Рингера с кальцием и коллагеназой. Затем осторожно встряхивайте раствор для переваривания в течение двух часов при температуре 18 °C. Когда большая часть цитов будет отделена, промойте ооциты раствором Рингера без кальция.

Затем инкубируйте ооциты в течение 10 минут в растворе Рингера без кальция при комнатной температуре. После этого тщательно промойте клетки в растворе Рингера с кальцием. Затем перенесите ооциты в раствор Рингера с кальцием для хранения перед инъекцией.

На следующем этапе достаньте синтезированную мРНК из морозильной камеры с температурой -20 °C. Добавьте 25 нанограммов мРНК до конечного объема 50 нанолитров. Затем введите мРНК в циты после проведения инъекции.

Поместите ооциты в раствор Рингера с добавлением гентамицина в концентрации 1 mg/mL и инкубируйте их при 18 °C в темноте от трех до семи дней. Это необходимо для экспрессии натрий-калиевого насоса в плазматической мембране ооцита. В день проведения эксперимента извлеките ооциты из инкубатора, поместите их в буфер для загрузки на 45 минут, а затем в буфер после загрузки на 45 минут.

Это повышает внутриклеточную концентрацию натрия для облегчения измерения работы натрий-калиевого насоса. Для проведения флуоресцентных измерений инкубируйте ооциты в буфере для пост-загрузки, содержащем 5 µM выбранного флуорофора, такого как TMRM или FM, в течение 5–10 минут в темноте. После маркировки флуорофором тщательно промойте ооциты буфером для пост-загрузки без красителя.

Держите ооциты в темноте, чтобы предотвратить фотообесцвечивание. Для подготовки к измерениям методом фиксации потенциала с помощью двух электродов начните с заполнения микроэлектродов 3 М раствором хлорида калия и проверки их сопротивления. Сопротивление должно составлять от 0,5 до 1,5 МОм.

Для проведения экспериментов по цистеиновому сканированию оснастите флуоресцентный микроскоп возбуждающим фильтром 5 35 DF 50, эмиссионным фильтром 5 65 EFLP и дихроичным зеркалом five 70 DRLP. Затем поместите оцит в камеру RC 10 на предметном столике флуоресцентного микроскопа. После этого осторожно введите оба микроэлектрода в оцит, используя усилитель для поддержания мембранного потенциала на постоянном значении.

Измерьте ионный поток через мембрану, активировав белок подходящим методом, таким как обмен раствора или изменение мембранного потенциала. Для одновременных флуоресцентных измерений используйте вольфрамовый источник света мощностью 100 ватт для возбуждения донорного флуорофора и фотодиод для регистрации изменений интенсивности флуоресценции при флуоресцентном мечении. После проведения цистеинового сканирования.

Измерьте изменение интенсивности флуоресценции при стационарном токе, используя скачки напряжения, управляемые программным обеспечением P clamp 10. Вторая часть протокола включает проведение измерений анизотропии одновременно с измерениями расстояния. Для расчета диапазона значений kappa squared измерение анизотропии позволяет определить относительную подвижность флуорофора за счет вращения.

Подробности расчетов приведены в сопроводительной статье. Для измерения ограничений расстояния используйте голофермент, который имеет два доступных внеклеточных остатка цистеина, способных связываться с флуорофорами. Добавьте буфер после загрузки, содержащий 1 µM FM и 4 µM TMRM.

Это донор и акцептор. К одной партии ооцитов с флуорофорами добавьте только 1 µM FM. Это только донорский флуорофор.

Добавьте еще четыре ооцита в другую группу; инкубируйте обе группы ооцитов на льду в темноте в течение 30 минут. Это позволит провести измерения ферментов halo, меченных и не меченных акцепторным флуорофором. Затем оснастите микроскоп возбуждающим фильтром 475 DF 40, эмиссионным фильтром 530 DF 30 и дихроичным зеркалом 505 DRLP.

Затем поместите ооцит в кювету на предметном столике флуоресцентного микроскопа. Поддерживая непрерывный поток раствора, измерьте временную зависимость выцветания донора в присутствии и в отсутствие акцепторного флора. Четыре. Эти результаты можно использовать для расчета расстояния между двумя остатками на натрий-калиевом насосе с помощью метода Фёрстера.

Для подтверждения функциональности белка следует проводить измерения методом двухэлектродного фиксации потенциала одновременно. Используя функцию clamp X в P clamp 10, рассчитайте средние значения результатов фоторазрушения донорного флуорофора как минимум для четырех записей с одного сайта. Для измерения относительного перемещения субъединиц белка используйте конструкции с двойными остатками цистеина, содержащие акцепторный и донорный флуорофоры.

Интенсивность флуоресценции в этих остатках не зависит от конформационного состояния белка и будет функцией расстояния между двумя флуорофорами. Далее замените набор фильтров в микроскопе на возбуждающий фильтр 475 AF 40, эмиссионный фильтр 595 AF 60 и дихроичное зеркало 505 DRLP. Затем поместите OI в камеру на предметном столике флуоресцентного микроскопа.

Затем донор возбуждается вольфрамовым источником света мощностью 100 watt, и измеряется интенсивность флуоресценции акцептора. Fluoro four измеряется с помощью подходящего метода, такого как вольтамперометрия лигандов или обмен растворов; активируют мембранный белок и одновременно измеряют изменение интенсивности флуоресценции. На этом рисунке показана корреляция транспорта ионов через клеточную мембрану и изменений интенсивности флуоресценции.

На верхнем графике представлены измерения в режиме фиксации тока (current clamp) в присутствии тестового раствора натрия и тестового раствора калия при концентрации ing 10 µM и 10 mM. На нижнем графике показаны изменения интенсивности флуоресценции, измеренные одновременно с измерениями в режиме фиксации тока. На данном рисунке изображены два ооцита, помеченные TMRM, акцепторным флуорофором четыре.

Ооцит слева экспрессирует натрий-калиевую АТФазу дикого типа, а ооцит справа — натрий-калиевую АТФазу с одним доступным остатком цистеина. Верхние кривые на данном рисунке представляют данные о переходном токе при подаче импульса напряжения. Нижние кривые показывают запись изменений интенсивности флуоресценции в режиме реального времени при подаче импульса напряжения.

На этом рисунке показана временная зависимость фотообесцвечивания; измеряется скорость фоторазрушения донора в отсутствие и в присутствии акцептора fluoro four. Фотообесцвечивание происходит быстрее без акцептора fluoro four. Каждая кривая представляет собой среднее значение четырех записей с одного участка. На этом рисунке показано относительное перемещение субъединиц при конформационных изменениях.

Изменения флуоресценции показаны красными линиями, а ток — черными линиями. Увеличение интенсивности флуоресценции, показанное слева, указывает на то, что поверхности с флуорофорами сближаются. Отсутствие изменений интенсивности флуоресценции, показанное в центре, означает, что расстояние между поверхностями с флуорофорами остается неизменным.

Снижение интенсивности флуоресценции, показанное справа, указывает на то, что флуорофоры удаляются друг от друга. При выполнении данной процедуры важно соотносить изменения кинетической и стационарной интенсивности флуоресценции с конформационными изменениями белка.