Исследование конформационной динамики мембранных белков На месте С Сайт-направленный флуоресцентная маркировка

Мы опишем метод, который измеряет кинетики ионного транспорта мембранных белков наряду с конкретным участкам анализ конформационных изменений с помощью флуоресценции от одиночных клеток. Эта техника адаптирована к ионные каналы, транспортеры и ионных насосов и может быть использована для определения расстояния между ограничениями белковых субъединиц.

Общая цель этой процедуры заключается в изучении подтверждающей динамики мембранных белков с использованием сайт-направленного флуоресцентного мечения на поверхности одиночных клеток. Это достигается путем сначала индивидуально мутирующих остатков на границе внеклеточного и трансмембранного доменов с цистином, как показано красным C.It затем необходимо определить, может ли этот остаток быть помечен реагирующим на цистин фтором 4. Вторым этапом процедуры является изучение того, влияют ли цистин, мутагенез и/или мечение флюоро-4 на кинетику и/или подтверждающее состояние белка.

Это выполняется с использованием показанной на рисунке конфигурации. Третьим этапом процедуры является сравнение и сопоставление изменений интенсивности флуоресценции с кинетическими параметрами целевого белка. Здесь показана типичная кривая флуоресценции.

Заключительным этапом процедуры является мечение мутировавших цистеиновых пар либо донорскими Fluor 4, либо донорскими акцепторными Fluor 4 для измерения скорости фоторазрушения в тандеме с измерениями напряжения для определения ограничений по расстоянию. На этом рисунке черным цветом показаны показатели фоторазрушения донора при отсутствии акцептора, красным цветом – разрушение донорского фото при наличии акцептора. В конечном счете, могут быть получены результаты, показывающие, что изменения интенсивности флуоресценции, которые являются результатом подтверждающих изменений белка, могут быть коррелированы с функцией мембранного белка с помощью флуориметрии с помощью зажима напряжения.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области мембранного транспорта ионов, например, как изменения в подтверждающем состоянии белка способствуют транспортировке малых молекул и ионов через плазматическую мембрану. Начните процедуру с клонирования натрий-калийного насоса в вектор, подходящий для xop постов, экспрессии ооцитов Лависа. Следующим шагом является проведение мутаций цистеина в остатках, расположенных на границе между трансмембранным и внеклеточным доменами, как описано в сопроводительной статье.

По завершении проверьте введение мутации с помощью секвенирования ДНК после транскрибирования плазменной ДНК в мРНК, как указано в сопроводительной статье, количественно оцените выход мРНК с помощью спектрофотометра до операции. Лягушку следует голодать в течение 12 часов, чтобы не допустить рвоты во время операции. Чтобы начать операцию на следующий день, погрузите лягушку в раствор анестетика до тех пор, пока лягушка не перестанет реагировать на пощипывание пальца ноги.

Извлеките лягушку из обезболивающего раствора и положите ее тыльной стороной вниз на впитывающую сторону подгузника. Положите на лягушку мокрое бумажное полотенце, чтобы лягушка оставалась влажной. Кроме того, если глаза лягушки открыты, поддерживайте их влажными с помощью солевого раствора.

Сделайте небольшой разрез на одной стороне средней линии лягушки. Найдите яичник и поднесите его к внешней стороне лягушки. Избегайте прикосновения яичника к коже.

Удалите завязь и поместите ее в чашку Петри с раствором Рингера. Проверьте оставшуюся ткань на предмет кровотечения, прежде чем поместить ее обратно в полость smic. Если кровотечение возникло, надавите стерильной ватной палочкой до упора.

Завершите операцию наложением швов на разрез с помощью прерывистого шва. Верните лягушку в ее жилище, чтобы она оправилась от наркоза, с помощью ножниц. Разделите изолированную долю яичника на более мелкие части.

Переложите комочки в раствор рингера плюс кальций с коллагеназой. Далее аккуратно встряхивайте раствор для варгеза в течение двух часов при температуре 18 градусов Цельсия. Когда большая часть цитов будет разделена, промойте ооциты раствором Рингера за вычетом кальция.

Затем инкубируйте ооциты в течение 10 минут в растворе рингера за вычетом кальция комнатной температуры. На этом этапе тщательно промойте циты в рингерах плюс раствор кальция. Затем перенесите ооциты в раствор Рингера плюс кальций для хранения перед инъекцией.

Для следующего шага извлеките синтезированную мРНК из морозильной камеры с температурой минус 20 градусов по Цельсию. Добавьте 25 нанограммов мРНК к итоговому объему в 50 нанолитров. Затем после инъекции введите мРНК в циты.

Поместите ооциты в раствор Рингера и один миллиграмм на миллилитр гентамицина и инкубируйте их при температуре 18 градусов Цельсия в темноте в течение трех-семи дней. Это позволяет натрий-калийному насосу экспрессироваться внутри плазматической мембраны ооцитов. В день эксперимента извлеките ооциты из инкубатора и поместите их в загрузочный буфер на 45 минут, а затем в буфер после загрузки на 45 минут.

Это увеличивает внутриклеточную концентрацию натрия для облегчения измерения натрий-калийного насоса. Для флуоресцентных измерений инкубируйте циты в буфере после загрузки, который содержит пять микромоляров нужного флуорофора, такого как TMRM или FM, в течение 5-10 минут в темноте. После мечения флоры четыре тщательно промойте ооциты постбуфером без красителей.

Держите ооциты в темноте, чтобы предотвратить фотообесцвечивание. Чтобы подготовиться к установке двухэлектродных зажимов, измерение напряжения начинается с заполнения микроэлектродов тремя молярами хлорида калия и проверки сопротивления. Сопротивление должно быть в диапазоне от 0,5 до 1,5 мегаом.

Для экспериментов по сканированию цистеина оснастите флуоресцентный микроскоп фильтром возбуждения 5 35 DF 50, эмиссионным фильтром 5 65 EFLP и диевым зеркалом с пятью 70 DRLP. Затем поместите окте в камеру RC 10 на предметный столик флуоресцентного микроскопа. Затем аккуратно вставьте оба микроэлектрода в окте с помощью усилителя, чтобы удерживать потенциал мембраны на постоянном значении.

Измерьте поток ионов через мембрану, активировав белок с помощью соответствующего метода, такого как обмен раствора или изменение мембранного потенциала. Для параллельных измерений флуоресценции используйте вольфрамовый источник света мощностью 100 Вт для возбуждения донора флуорофора и для закрепления 0 2 2 A photo DDE для обнаружения изменений интенсивности флуоресценции для флуоресцентного мечения. После сканирования цистеином.

Измерьте изменение интенсивности флуоресценции при неподвижном токе с помощью ступеней напряжения, которые контролируются программным обеспечением P clamp 10. Вторая часть протокола включает в себя проведение измерений атропии наряду с измерениями расстояния. Чтобы вычислить диапазон значений каппа в квадрате, атропия измеряет относительную подвижность флюорочетверки из-за вращения.

Подробности расчетов см. в сопроводительной статье. Чтобы измерить ограничения по расстоянию, используйте голофермент, который имеет два доступных внеклеточных остатка цистеина, которые можно пометить флюорочетверами. Добавьте буфер после загрузки, содержащий один микромолярный FM и четыре микромолярных TMRM.

То есть донор и акцептор. Флюорочетверы к одной партии ооцитов добавляют только один микромоляр FM. То есть только донорский фтор.

От четырех до другой партии ооцитов инкубируют обе партии ооцитов на льду в течение 30 минут в темноте. Это позволяет проводить измерения ферментов холло, меченных акцептором флюорочетвертюром и без него. Затем оснастите микроскоп фильтром возбуждения 4 75 DF 40, фильтром излучения 5 30 DF 30 и дихроичным зеркалом 5 0 5 DRLP.

Затем поместите ооцит в камеру на предметный столик флуоресцентного микроскопа. Поддерживая непрерывный расход раствора, измеряйте зависимость донора от времени отбеливания при наличии и отсутствии акцепторной флоры. Четыре. Эти результаты могут быть использованы для расчета расстояния между двумя остатками на натрий-калийном насосе с использованием насоса Forester's.

Уравнение: Измерения напряжения двух электродов должны быть выполнены одновременно, чтобы убедиться в работоспособности белка. Используя функцию зажима X в зажиме P clamp 10, усреднить результаты фотодеструкции донорного флюорогенератора 4 для минимум четырех записей сайта oh. Для измерения относительного движения белковых субъединиц используют двойные цистеиновые конструкции, которые содержат акцепторные и донорские флюорочетверки.

Интенсивность флуоресценции в этих остатках нечувствительна к подтверждающему состоянию белка и будет зависеть от расстояния между двумя четверками. Затем измените набор фильтров в микроскопе на фильтр возбуждения 4 75 a F 40, фильтр излучения 5 95 a F 60 и дихроичное зеркало 5 0 5 DRLP. Затем поместите ОИ в камеру на предметный столик флуоресцентного микроскопа.

Далее донор возбуждается вольфрамовым источником света мощностью 100 Вт и интенсивностью флуоресценции акцептора. Fluoro 4 измеряют с помощью соответствующего метода, такого как напряжение лиганда или обмена раствора, активируют мембранный белок и одновременно измеряют изменение интенсивности флуоресценции. На этом рисунке показана корреляция переноса ионов через клеточную мембрану и изменения интенсивности флуоресценции.

Верхняя кривая показывает измерения тока в присутствии тестового раствора натрия и тестового раствора калия в присутствии 10 микромоль и 10 миллимоль. Нижняя кривая показывает изменения интенсивности флуоресценции, измеренные в тандеме с измерениями тока клещей. На этом рисунке показаны два ооцита, помеченные TMRM, акцептор флюор четыре.

Ооцит слева экспрессирует натриевый калий дикого типа, в то время как ооцит справа экспрессирует натрий-калий-APA с одним доступным остатком цистеина. Верхние следы этого рисунка показывают данные о переходном токе при импульсе напряжения. Нижние трассы показывают запись изменений интенсивности флуоресценции в реальном времени при импульсе напряжения.

На этом рисунке показана временная зависимость фотообесцвечивания донорской фотодеструкции при отсутствии и наличии акцептора фтор-4. Фотообесцвечивание происходит быстрее без акцептора флюоро-4. Каждая трассировка является средним значением четырех записей на сайте. На этом рисунке показано относительное перемещение субъединиц при подтверждении изменений.

Изменения флуоресценции показаны красными дорожками, а протекание тока — черными дорожками. Увеличение интенсивности флуоресценции, показанное слева, указывает на то, что флорные этажи сближаются. Отсутствие изменения интенсивности флуоресценции, показанное в середине, указывает на то, что расстояние Fluor four остается статичным.

Уменьшение интенсивности флуоресценции, показанное справа, указывает на то, что четверки флуоресценции раздвигаются дальше друг от друга при попытке выполнить эту процедуру. Важно помнить о корреляции изменений интенсивности кинетической и стационарной флуоресценции с подтверждающими изменениями в белке.