Изготовление Micropatterned гидрогелей для нейронных системах культуры с использованием динамических Фотолитография Проекция маски

Общей целью этой процедуры является создание микроструктурированной двойной гидрогелевой системы культивирования клеток для нейронных исследований. Это достигается путем первичной установки имплантатов тканей, таких как эмбриональные, ганглии дорсальных корней, на вставки проницаемых клеточных культур. Далее создается микроузор в фотосшиваемом гидрогеле с помощью цифрового микрозеркального устройства или DMD в качестве динамической фотомаски.

Далее следует добавление самоорганизующегося гидрогеля в чистом виде, который может содержать суспензию диссоциированных клеток. Перед клеточным анализом необходимо правильное время инкубации. В конечном счете, могут быть получены результаты, которые показывают жизнеспособность нейронных клеток и рост нейритов через определенные геометрические конфигурации, определенные DMD.

Основное преимущество этого метода перед существующими методами заключается в том, что динамическая фотомасса может быть быстро создана, изменена и спроецирована на расстояние, чтобы вместить практически любой субстрат, такой как проницаемые вставки клеточных культур. Хотя этот метод может дать представление о нейронных системах, он также может быть применен к другим системам, которые могут извлечь выгоду из определяемых геометрических ограничений, таких как клеточная сигнализация, миграция клеток, межклеточный контакт или морфогенез, и это лишь некоторые из них. Плата DMD, направляющая для ультрафиолетовых ламп и четырехкратная линза объектива установлены вертикально на виброизоляционном столе.

Перевернутый микроскоп помещается под линзой объектива таким образом, чтобы фокусирующий свет, отраженный от DMD, можно было визуализировать через микроскоп. Для получения дополнительной информации о настройке DMD, пожалуйста, ознакомьтесь с прилагаемым письменным протоколом. Во-первых, подготовьте шесть хорошо покрытых коллагеном вкладышей для клеточных культур для приема X explan, покройте стенки вставок клеточных культур дождем, стараясь не наносить дождь X на саму мембрану.

Затем добавьте во вкладыши 1,5 миллилитров аиновой среды и выдерживайте в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. На следующий день после забора эмбриональных ганглиев дорсального корня из Е 15 детенышей крыс накладывают до четырех DRG на каждый покрытый коллагеном слой. Шесть. Вставьте и инкубируйте в течение двух часов при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа, чтобы позволить DRG прилипнуть к мембране.

После инкубационного периода ДРГ будут готовы к фотополимеризации. Цифровое микрозеркальное устройство представляет собой массив отдельных зеркал размером 1024 на 768, который избирательно отражает свет в зависимости от положения зеркала. В этой процедуре DMD используется для моделирования ультрафиолетового света на фотоCRO, связываемых гидрогелях, создавая заданную геометрию гидрогеля простым и быстрым способом.

Несмотря на то, что наш DMD является автономным устройством, устройство также может быть интегрировано для использования со многими существующими микроскопами. Сначала извлеките растения DRGX из инкубатора, отсасывайте всю лишнюю жидкость из вкладыша. Затем добавьте внутрь вкладыша 500 микролитров полимеризационной среды.

Перенесите вставки с растениями DRGX на предметное стекло и поместите предметное стекло под DMD. Используйте программу ALP three basic graphic user interface для загрузки черно-белого изображения, которое будет использоваться в качестве фотомаски, на DMD. В данном случае была выбрана разветвляющаяся форма, позволяющая реализовать системы наведения нейритов с использованием инвертированного микроскопа и DI видимого источника света.

Выровняйте эксплан ткани с соответствующим местом на фотомаске, используя в качестве ориентира свет, отраженный от DMD. Затем переключите источник видимого света на источник ультрафиолетового света. Осветите полимеризационную среду внутри клеточной культуры.

Вставляйте до тех пор, пока не будет завершено сшивание ПЭГ. Повторите для каждой DRG на вкладыше. Затем промойте каждый вкладыш три раза стерильным фосфатным буферным раствором, содержащим 1% пенициллина стрептомицина.

Наконец, добавьте 1,5 миллилитра питательной среды под вкладыши для клеточных культур и дайте сбалансироваться в инкубаторе для тканевых культур при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа в течение 30 минут. В течение инкубационного периода обрабатывайте ультразвуком чистую матрицу в течение 30 минут. Для растворения пептидов разведите прилагаемый 1%-ный раствор до 0,15% в стерильной воде и добавьте один микрограмм на миллилитр растворимого ламинина.

Через 30 минут извлеките культуры из инкубатора и отсасывайте все излишки среды из вкладыша. Затем, визуализируя пустоту под микроскопом, аспирируйте среду изнутри пустой области в конструкции PEG, содержащей экстрапланирующую пипетку DRGX вокруг одного микролитра чистого матричного раствора, в пустоту вокруг X-эксплана. Следите за тем, чтобы чистая матрица не переполняла пустоту штифта.

Затем пипеткой нанесите 1,5 миллилитра питательной среды под вкладыш и поместите в инкубатор для тканевых культур при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа на один час. Чтобы обеспечить тотализацию по истечении этого времени, замените питательные среды, а затем верните культуры в инкубатор. Питательные среды заменяют через каждые 48 часов культивирования.

Примеры двойных гидрогелевых конструкций, содержащих растения DRGX, показаны здесь. Растения DRGX имеют маркировку по маркерам роста и распространения. Полимеризованная конструкция ПЭГ выглядит серой, DRG NEURITS, меченные бета-3 тубулином, выглядят зелеными, а ядра клеток DPI окрашиваются в синий цвет.

Обратите внимание, что клеточная миграция и ретикальное растяжение ограничены клеточной пермиссивной областью двойной гидрогелевой конструкции. Двойная гидрогелевая инкапсуляция целесообразна при использовании любого самоорганизующегося геля, фотосшиваемого геля. В этом случае ПЭГ служит структурной опорой для геометрического представления самоорганизующегося геля.

Например, чистая матрица или арис. Тип геля и выбор фотомаски будет зависеть от конкретного желаемого применения. Обработайте стенки полиэфирной вставки для клеточных культур дождем X, как показано ранее.

Наденьте вставку на предметное стекло с дождевым X-образным покрытием и поместите под DMD. Далее добавьте во вкладыш 500 микролитров полимеризационной среды. Загрузите соответствующую маску на DMD для этого эксперимента на выживание.

Цилиндрическое представление чистого матрикса используется для помощи в визуализации клеток. Подвергайте вставку воздействию ультрафиолетового света в течение 55 секунд, чтобы вызвать сшивание стержня после сшивания. Вновь образовавшуюся пустоту промыть стерильным DPBS и 1% шприц-карандашом.

Используйте микропипетку или стерильный аппликатор с ватным наконечником, чтобы удалить всю лишнюю жидкость из пустоты. Приготовьте чистый Matrixx by Sonicate в течение 30 минут, разведите до 0,15% в стерильной воде, добавив один микрограмм на миллилитр растворимого ламинина и 10% сахарозы. Далее гранулируют клетки, которые будут культивироваться, методом центрифугирования.

Тщательно отсасывайте среду из клеточной гранулы и повторно суспендируйте гранулу в концентрации приблизительно пять раз по 10 до трех клеток на миллилитр в 0,15% чистом матричном растворе. Крайне важно, чтобы вся среда отсасывалась из клеточной гранулы, так как чистая матрица начинает самособираться при контакте с солевым раствором. Затем внесите пипеткой около одного микролитра добавленной чистой матричной клеточной смеси в пустоту ПЭГ.

Этого объема обычно достаточно, чтобы заполнить пустое пространство без переполнения пипеткой 1,5 миллилитров питательной среды под вкладышем. Затем поместите вторичный гидрогель с чистой матрицей в инкубатор для тканевых культур при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа на один час, чтобы обеспечить полное залачивание геля по истечении этого времени, отсасывайте среду и добавьте свежую среду под вкладыш. Заботясь о том, чтобы не повредить механически слабую чистую матрицу.

Верните культуры в инкубатор для тканевых культур и меняйте среду после каждых 48 часов посева. Вот примеры живых нейронов DRG, инкапсулированных в различные двойные гидрогелевые конструкции. После 48 часов в питательной среде клетки были помечены кальцием и живым клеточным маркером, который выглядит зеленым.

Здесь из-за динамического характера фотошаблона DMD геометрия, доступная для инкапсуляции, ограничена только размерами и разрешением оптики. Целесообразно использовать одну гидрогелевую инкапсуляцию, при которой клетки могут быть исследованы внутри фотосшиваемого гидрогеля, соответствующего культуре клеток из полиэстера. Вставьте с помощью дождевого X и поместите под DMD на предметное стекло с дождевым покрытием X.

Как и раньше, культивируемые клетки пипетируют непосредственно в полимеризационную среду в нужной концентрации и хорошо перемешивают для обеспечения однородного распределения. Затем пипеткой впрысните 500 микролитров клеточной смеси полимеризационной среды во вкладыш. Выберите подходящую маску и загрузите ее на DMD, индуцируйте кросслинкинг ПЭГ путем воздействия ультрафиолетового света в течение 55 секунд.

Для исследований выживаемости клеток используется базовая круглая маска, представляющая собой цилиндр: промойте вкладыш три раза стерильным DPBS и 1% стрептококком, затем нанесите пипеткой 1,5 миллилитра питательной среды под вкладыш и достаточное количество питательной среды сверху, чтобы полностью погрузить вкладыш в инкубацию при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа со сменой среды каждые 48 часов. Вот пример живых диссоциированных корковых нейронов, инкапсулированных внутри стержня. Живые клетки помечены кальцием и выглядят зелеными, в то время как мертвые клетки помечены гомодимером и выглядят красными.

Инкапсуляция в ПЭГ приведена только в качестве примера, так как ПЭГ не представляет собой идеальную среду для нервных клеток. Выбранная геометрия представляет собой простое средство для изучения жизнеспособности клеток, но может быть адаптирована к широкому спектру структур. Тонкопленочные гидрогели могут быть использованы для создания специфических узоров ограниченных клеток.

Опять же, обработайте полиэфирную клеточную культуру вставкой с дождевым X, как и раньше, и поместите на предметное стекло, обработанное дождем. Затем пипеткой впрыскивают от 250 до 300 микролитров полимеризационной среды на дно вкладыша обработанной клеточной культуры. Этого объема достаточно для того, чтобы просто покрыть нижнюю часть вкладыша, инкубировать при комнатной температуре от 30 до 45 минут, чтобы среда проникла внутрь мембраны, аспирировать излишки среды из вкладыша с помощью микропипетки.

Затем нанесите пипеткой достаточное количество УФ-прозрачного масла в нижнюю часть вставки, чтобы полностью покрыть область. Инкубируйте вкладыш при комнатной температуре в течение 15-30 минут, что достаточно для того, чтобы масло образовало отчетливый слой над полимеризационной средой. Пропитав мембрану вставки, загрузите соответствующую маску на DMD.

После установки вставки и направляющей под ДМД индуцируют сшивание колышков под воздействием ультрафиолетового света. Промойте вкладыш три раза стерильным DPBS и 1% ремнем ручки после стирки, перенесите вкладыш в шестилуночный планшет для культуры тканей и гранулируйте клетки, подлежащие культивированию. Аспирируйте среду и ресуспендируйте клеточную гранулу в питательной среде в желаемой концентрации от 10 до 4 и от 10 до шести клеток на миллилитр.

Затем пипеткой вносятся достаточный объем клеточной суспензии внутрь вставки для клеточной культуры для получения желаемой плотности клеток. Добавьте достаточное количество питательной среды под вставку, чтобы полностью сохранить жизнеспособность клеток. Инкубировать при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислом газе после 48 часов инкубации.

Промойте вкладыш три раза стерильным DPBS и 1% стрептококком, чтобы удалить все непроветриваемые клетки. Затем добавьте в лунки свежие питательные среды. Верните планшет в инкубатор для тканевых культур и выполняйте смену среды каждые 48 часов.

Здесь рестриктивный ПЭГ был полимеризован в виде тонкой пленки с использованием тестовой модели для селективного прикрепления диссоциированных клеток к покрытой коллагеном мембране проницаемых опор. Клетки были помечены после 48 часов инкубации. Живые клетки, помеченные calc am, отображаются зеленым цветом, в то время как мертвые клетки помечены гомодимером atherium one и кажутся красными.

Можно видеть, что минимальное количество клеток aian происходит в области, содержащей их тонкую пленку PEG. Это пример нежелательного результата. Частичная полимеризация ПЭГ привела к тому, что конструкция из колышков пришла в негодность.

Неправильная полимеризация может произойти из-за наличия мениска в предполимерной среде, недостаточных количествах полимеризации, среды, недостаточного воздействия ультрафиолета или неправильной фокусировки оптики. Это пример некачественной двойной гидрогелевой 3D-инкапсуляции культуры растений A-D-R-G-X. На этом изображении видно, что нейриты, видимые зеленым цветом, смогли вырасти за пределами узорчатых каналов.

Это часто происходит, если чистая матрица переливается поверх части ПЭГ во время инъекции. Следуя этой процедуре. Другие стандартные методы, такие как пережатие пластыря или иммуногистохимия, могут быть выполнены, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как электрофизиология или фенотипическая экспрессия.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как использовать динамическую проекционную фотолитографию по маске для уточнения геометрического представления одиночных или двойных гидрогелевых систем для исследования культур нейрональных клеток.