Вестерн-блоттинг Использование Invitrogen NuPage Novex бис Трис MiniGels

Здравствуйте, меня зовут О.Б. Пена. Я работаю в лаборатории Майкла Кара на факультете физиологии и биофизики Калифорнийского университета. И сегодня я покажу вам, как провести вестерн-блоттинг с использованием новой страничной системы из отдельного гена.

Это базовая методика анализа экспрессии белка для проверки результатов экспериментов по осаждению. Таким образом, западные методы обработки крови включают в себя три основных этапа: загрузку и запуск геля, перенос белка из геля на нитроцеллюлозную мембрану и иммунозондирование мембраны. Сегодня я буду использовать эту технику для анализа экспрессии белка в транслируемых клетках.

Поэтому я готовлю образец таким образом, чтобы образец белка всегда реагировал в буфере для образца X. Этот буфер для образца содержит краситель, который помогает вам загрузить отходы, и глицерин крови, чтобы помочь образцу попасть на дно колодца. Он также содержит буфер и LDS. Это детергентный отрицательный заряд, который мы можем получить от белка и белка с некоторым мигрировать в электрических полях, учитывая молекулярную массу и нормализовав заряд.

Вам также нужно добавить некоторые восстановители, такие как DTT, чтобы сломать кость. Поэтому образцы нагреваются 10 минут при 70 градусах, чтобы полностью натуральный белок и быстро вращались. Итак, теперь я приготовлю гель.

Итак, мы используем сборный гель, поэтому нам нужно разрезать упаковку, взять гель, снять защиту. Итак, теперь я готов ответить на вопрос о геле в сетап. Так что при попадании геля неправильная ориентация, поэтому катание должно быть обращено к вам, а открытые части – к центральной части клеток.

Итак, сначала вам нужно плотно закрыть утечку и добавить немного буфера в центральных частях. Я знаю, что добавлю буфер для бега в других частях, во внешних частях, вам нужно поставить достаточно буфера, чтобы гель не нагревался во время бега. Нет, я возьму на себя взлет C. Да, вам нужно двигаться медленно и вертикально, чтобы вы загружались снизу и медленно двигались вверх, и просто убедитесь, что вы избегаете пузыря.

В конце концов, я собираюсь загрузить семь образцов, и у меня было три молекулярных веса. Это помогло бы мне разрезать мембрану после переноса, чтобы блокировать разные пути, разные антитела, просто чтобы знать, где я могу разрезать мембрану и где находятся мои образцы. Итак, здесь у вас есть три эталона и после переноса будет разрезана посередине эталона мембрана.

Итак, здесь у вас будет один блок вздутия живота с одним антителом, а вот семь частей, которые будут вздуты с другим антителом. Просто убедитесь, что когда вы загружаете гель, вы загружаете всю лунку и что вы загружаете J лунку почти с тем же объемом, чтобы обеспечить хорошую миграцию. Теперь я готов запустить J.So подключаем аппарат к источнику питания.

Таким образом, это только один из способов установить переключатель проводов, чтобы вы могли запускать гель либо при постоянном напряжении, либо при постоянном токе. Итак, мы устанавливаем постоянное напряжение и для первой части мы просто устанавливаем напряжение примерно на 60-70 вольт. Когда я подаю ток, вы увидите пузырьки, которые появляются, что означает, что у вас хорошая проводимость, и вы увидите, как белки начинают мигрировать в нижнюю часть геля к положительным электродам.

Из-за DS-отрицательной диаграммы, которая кодирует белок для первой части геля, это называется укладкой, просто чтобы уложить белок в одну единственную связь, это низкая концентрация IDE, и на втором этапе прогона я увеличиваю напряжение до ста 75 вольт. Прошло полтора часа. И, судя по положению стандартов, вы можете знать, где будет находиться ваш белок в соответствии с молекулярной массой и по сравнению с молекулярной массой различных нерожденных детей стандарта, который вы можете видеть.

Итак, еще один, бег окончен, и я сниму гель с клеток патогена в буфере для переноса. То есть код с помощью щипцов или шпателя. Вы разделяете две части прекурсора и берете, вы разрезаете часть с лункой, я могу осторожно взять гель и поместить гель в буфер.

Нет, мы выполним трансфер. Это значит, что мы перенесем белок из геля в сторону мембранной нитроцеллюлозной мембраны. И для этого мы будем использовать би био крысиные системы.

Это перенос жидкости. Другие системы существуют как полусухие переносы, в зависимости от того, что есть в вашей лаборатории. Итак, различными частями системы являются кубы, система переноса с этими вещами для приготовления ваших бутербродов.

Так что принцип тот же для phys, на этот раз это горизонтальный электролиз. Поэтому вы приготовите бутерброд с двумя подушечками, чтобы бутерброд оставался очень влажным. Положите ваш гель на мембрану и два мокрых человека бумаги с каждой стороны и положите бутерброд в систему и белок.

И снова мы мигрируем в сторону положительного электрода от геля к мембране. Так что вам нужно добавить свой собственный буфер для переноса в блюдо. Итак, вы выгоняете пузырь из сковороды.

Можно ли положить первую подушечку на дно бутерброда? Возьмите одну бумагу Whiteman, положите в буфер и пусть буфер пройдет через капилляр, и плюс прижмите белых людей поверх подушечки. Еще раз избавьтесь от бурбона. Теперь вы нажимаете на гель, и ваши дети были лучшей частью тюрьмы.

Итак, вы берете свою естественную мембрану, вы можете либо вырезать угол, либо написать что-то на ней, чтобы запомнить ориентацию. Как вы можете видеть, я пишу цифру в верхнем правом углу, чтобы запомнить ориентацию моей мембраны. Нет, я сделаю мембрану в банке, поместим мембрану поверх геля в хорошей ориентации, добавив новую бумагу Уайтмена и погоню за буром.

Важным шагом в процессе перевода является избежание пузыря. Вы есть, это очень важно. Не располагайте пузырьков между мембраной и гелем, иначе белок не будет передаваться.

Вы добавляете последнее заклинание И закрываете это на котором, И вы вставляете сэндридж в систему. Черная часть обращена к черной части систем. Если у вас есть два геля, вы повторяете ту же операцию с другим и заполняете ствол буфером для переноса.

Так что теперь я добавлю самый высокий блок для переноса, закрою систему и переведу свой белок на один час на сто вольт в коде. Могу ли я также перенести белок на ночь при напряжении 20 вольт? Так что теперь он стал более водяным, и пересадка закончилась.

Итак, перейдем к следующим этапам, которые – иммунозондирование мембраны. Итак, первое, что нужно сделать, это вынуть мембрану из бутерброда. Итак, вы поместили мембрану в кремовое дерево, как вы можете видеть, зная, что стандарты находятся на мембране, а не на вашем геле.

Чтобы проверить эффективность переноса, я проведу окрашивание. Это обратимое окрашивание белка, и вы работаете с водой. Таким образом, вы не можете видеть, что белки стоят красными, и это правильный перенос.

Итак, теперь у вас есть раствор для блокировки, так что либо PBS, либо TBS буфер с 5% молока или кофеина, либо B 2% BSA. В этом и есть цель. Она заключается в том, чтобы покрыть мембрану белками и заблокировать все неспецифические участки.

Так что на следующем этапе вы будете вводить свои антитела не будут неспецифически связываться с вашей мембраной. И оставляем мембрану в таком виде минимум на 30 минут при температуре. После одного часа в блокирующем растворе мембрана готова к зондированию первичным антителом.

Итак, вы выливаете в раковину раствор для блокировки и добавляете на мембрану первичный раствор антитела. Первичное антитело также разводится в блокирующем растворе, и вы инкубируете мембрану в течение одного или двух часов при комнатной температуре или в течение ночи при четырех градусах Цельсия. После инкубации с первичным антителом вы промывайте мембрану три раза по 10 минут PBS или TBS CONT, содержащим 0,05% от 20.

Таким образом, если вы налили раствор в раковину и добавили раствор для стирки, или если хотите, вы можете держать раствор антител на уровне четырех градусов или минус 20 градусов. После выполнения трех желаний вы инкубируете мембрану с антителом, связанным с красноватой пероксидазой, в течение одного часа при температуре. В нашем случае мы инкубировали мембрану с первичным антителом напрямую по сравнению с HRP.

Итак, мы просто делаем три сыпи и обнажаем отходы. Ваге не парят, и мембрана готова к раскрытию. Таким образом, есть другой способ обнаружить свой белок на западной мембране крови.

Сегодня мы будем использовать люминесцентный тест Кима: вы берете мембрану, сушите ее на влажной бумаге, кладете в чистый лоток или готовите раствор для подложки и наносите раствор на мембрану на пять минут. Для мини гена достаточно одного-двух мл. Прошло пять минут.

Нет, мы готовы обнажить мембрану. Итак, вы берете мембрану, сушите ее на белой бумаге и помещаете ее в пластиковую полировку или сыворотку, обернутую в западную кассету с кровью, которую вы сливаете. Жидкость — это наблюдение за бумагой, которую вы видите, и вы идете в темную комнату, чтобы обнажить пленку на мембране.

Мы находимся в темной комнате. Нет, я собираюсь экспонировать пленку на мембране в течение одной минуты. Этот этап нужно выполнять в темное время суток.

Так что вы просто увидите результаты в конце своего фильма. Вы можете изменить время экспозиции. Я представляю фильм в проявщике.

Так что мы только что получили наш фильм от разработчика. И чтобы точно знать размер полосы, которую вы можете видеть на пленке, вам нужно расположить пленку на мембране и написать на пленке положение стандартов белка. Для того, чтобы расположить пленку, вы выравниваете флуоресцентную наклейку по меткам на поле и отмечаете стандарты.

В этом конкретном эксперименте я трансфицировал клетки htt с растущим количеством ДНК. Здесь, здесь у вас есть линейное соответствие на неинфицированных клетках, а здесь увеличивается количество ДНК, которое соответствует возрастающему количеству экспрессируемого белка. Здесь также можно наблюдать неспецифическую кость.

Это просто фон антитела, потому что оно также присутствует в неспецифических неспецифических клетках. После того, как вы выпьете фи, вы можете взять мембрану, промыть ее в PBST. На этом этапе вы можете сохранить мембрану и повторить процедуру иммуноокрашивания с другим антителом.

После снятия мембраны вы также можете поймать ее на разные части, чтобы использовать разные антитела. Используйте в PBST или блокирующий раствор, я просто показываю вам, чтобы выполнить западную кровь. Как вы видели, моя сущность выражается во мне самом.

Так что желаю вам такой же удачи в ваших Экспериментах.