Изучение сотовый Роллинг Траектории на ассиметричные паттерны рецепторов
13 февраля 2011 г.
Мы опишем протокол наблюдать и анализировать подвижного траекторий на асимметричные рецепторов узором субстратов. Полученные данные являются полезными для инженерно рецептора узором субстраты для этикетки без разделения клетки и анализа.
В данном протоколе описываются наблюдение и анализ траекторий перекатывания клеток на асимметричных паттернах рецепторов для разработки подложек с определенным распределением рецепторов, предназначенных для бесмаркерного разделения и анализа клеток. Начните с микроконтактной печати молекул PEG на золотой подложке для создания чередующихся паттернов самоорганизующихся монослоев, после чего заполните свободные участки подложки рецепторами P-селектина. Затем установите подложку в проточную камеру. Подайте суспензию клеток HL 60 в камеру.
Запишите последовательность изображений процесса роллинга клеток HL 60 на паттернах P-селектина и проанализируйте изображения, конвертированные из видео. Траектории роллинга, отслеживание края клеток, длину пути и скорости роллинга на плоскости, в области и на краю можно получить с помощью программы MATLAB. Данный метод позволяет понять, как клетки HL 60 перемещаются по асимметричным паттернам рецепторов в сдвиговом потоке.
Этот метод может быть применен для количественной оценки взаимодействий на поверхности других клеток, прямого анализа клеток путем наблюдения за их траекториями на рецепторных паттернах, а также для разработки устройств с микрорельефом для сепарации клеток. Микроконтактная печать используется для создания чередующихся паттернов самособранных монослоев молекул PEG на золотой подложке.
Сначала нанесите на штамп из PDMS раствор PEG в этаноле с концентрацией 5 мM. Дайте поверхности высохнуть в течение 20 минут. Осторожно приложите штамп к золотой поверхности на 40 секунд, обеспечив плотный контакт между золотой поверхностью и штампом.
Избыточное давление не требуется. Промойте поверхность этанолом и высушите потоком азота. Затем, используя перфузионную камеру, инкубируйте подложки в растворе P-селектина в концентрации 15 µg/mL в течение трех часов при комнатной температуре для нанесения P-селектина на оставшиеся участки; промойте камеру, после чего заполните поверхности 1 mg/mL BSA в течение одного часа для блокирования неспецифических взаимодействий.
Перед проведением эксперимента по роллингу клеток промойте поверхность буфером DPBS. Соберите проточную камеру, затем пропустите через прямоугольную проточную камеру с углом наклона поверхности рецепторного паттерна 10 градусов суспензию клеток HL 60 с концентрацией 10⁵ клеток на мл.
При комнатной температуре 24.5 °C настройте шприцевой насос так, чтобы скорость потока составляла 75 µL/min, что соответствует ламинарному напряжению сдвига 0.5 dyn/cm². Затем с помощью инвертированного микроскопа и установленной камеры запишите процесс роллинга клеток HL 60.
Взаимодействия с адгезивными p-селектином и субстратами. Используйте объектив 4x при частоте съемки один кадр в секунду в течение 300 секунд. Проведите три независимых эксперимента.
Представьте данные в виде среднего значения и стандартного отклонения средних величин, полученных в каждом эксперименте. Изображения микроскопа получены путем конвертации видеозаписи HL 60.Rolling. Взаимодействия с адгезивным p-селектином и субстратами демонстрируют светлые и темные области, соответствующие рецептору p-селектина и областям PEG соответственно.
Здесь трассы определяются с помощью специализированной программы MATLAB. Угол наклона края составлял 10 градусов, а касательное напряжение — 0,5 дин на квадратный сантиметр. Далее проводится анализ распределения длины краевых трасс, среднего значения длины краевых трасс, а также VE и VP — скоростей качения на краях и внутри лент.
После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как анализировать траектории клеток при асимметричных паттернах рецепторов.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе описываются наблюдение и анализ траекторий качения клеток на асимметричных паттернах рецепторов для облегчения разработки подложек с паттернами рецепторов, предназначенных для безмаркерного разделения и анализа клеток.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Биология клетки
- Биоматериалы
- Микрофлюидика
Теоретические основы
- Перекатывание клеток является критически важным процессом в различных биологических взаимодействиях.
- Асимметричное распределение рецепторов может влиять на поведение клеток.
- Безметковые методы имеют важное значение для сепарации и анализа клеток.
- Микроконтактная печать представляет собой полезный метод создания структурированных подложек.
Цель исследования
- Разработать протокол наблюдения за перекатыванием клеток на подложках с паттернами рецепторов.
- Проанализировать траектории перекатывающихся клеток для оптимизации проектирования подложек.
- Изучить динамику движения клеток в условиях потока.
Используемые методы
- Микроконтактная печать молекул PEG на золотой подложке.
- Создание чередующихся паттернов самоорганизующихся монослоев.
- Заполнение оставшихся участков подложки P-селектином и рецепторами.
- Размещение в проточной камере и визуализация роллинга клеток HL-60 на паттернах.
Основные результаты
- Были записаны последовательности изображений взаимодействий клеток HL-60.
- Траектории катящихся клеток были проанализированы с помощью MATLAB.
- Были получены данные о длине отслеживания краев и скоростях качения.
- Были представлены сведения о движении клеток по асимметричным паттернам рецепторов.
Выводы
- Данный протокол позволяет провести детальный анализ динамики роллинга клеток.
- Для эффективного разделения клеток могут быть созданы асимметричные паттерны рецепторов.
- Этот метод способствует пониманию поведения клеток в сдвиговом потоке.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Понимание траекторий перекатывания клеток по асимметричным паттернам рецепторов позволяет осуществлять рациональное проектирование безмаркерных микрофлюидных устройств для разделения. Данный протокол предоставляет количественные данные о длине отслеживания края и скорости перекатывания при определенном напряжении сдвига, что поддерживает прогностическое моделирование поведения клеток в потоке. Такие данные позволяют сократить количество эмпирических итераций при разработке устройств для очистки клеток и рабочих процессов фенотипического анализа.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать кинетику связывания лиганда с рецептором в условиях физиологического сдвига, что дает данные для валидации мишеней в путях, опосредованных адгезией.
- Практическая ценность: предоставляет безметочный метод оценки функциональной активности рецептора без использования флуоресцентных меток или генетических репортеров.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: позволяет получать количественные показатели скорости перекатывания клеток и длины траектории движения вдоль края для сравнительного анализа при различных плотностях рецепторов или геометриях паттерна.
- Практическая ценность: стандартизирует подготовку подложки с помощью микроконтактной печати и интеграцию с потоковой камерой для обеспечения воспроизводимости анализов адгезии.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: способствует снижению технических рисков при разработке стратегий разделения на основе адгезии путем установления связи между дизайном паттерна рецепторов и наблюдаемыми траекториями движения клеток.
- Практическая ценность: позволяет проводить скрининг фенотипов клеток на основе их поведения при перекатывании, что полезно для обогащения субпопуляций в доклинических моделях.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод применяется на ранних этапах поиска для оптимизации разработки анализа и создания доклинических инструментов, особенно для тех мишеней, где адгезия в условиях потока служит функциональным показателем.
- Фундаментальная биология: облегчает проверку гипотез о взаимодействиях рецептора и лиганда в условиях сдвигового потока, проясняя механизмы, способствующие качению клеток.
- Скрининг: обеспечивает стандартизированные количественные показатели адгезии, позволяющие сравнивать клеточные линии или модуляторы рецепторов.
- Аналитика: предоставляет данные о распределении длины трекинга края и скорости качения, создавая статистическую базу для сравнения условий.
- Трансляционные исследования: связывает динамику качения in vitro с потенциальным применением в устройствах для безмаркерного разделения клеток при доклинической обработке образцов.
- Корпоративное повторное использование: создает многократно используемую платформу для оценки поведения клеток, опосредованного адгезией, для различных мишеней и типов клеток.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает точность прогнозирования механизмов разделения на основе адгезии путем количественного определения параметров траектории в условиях контролируемого сдвига.
- Практическая ценность: обеспечивает воспроизводимость за счет стандартизации микроконтактной печати, заполнения рецепторов и настройки проточной камеры.
- Стратегическая ценность: снижает биологические риски на поздних этапах разработки устройств, обеспечивая функциональную валидацию паттернов рецепторов на ранней стадии.
- Влияние на портфель разработок: способствует принятию решений о целесообразности дальнейшей разработки технологий микрофлюидного разделения, предоставляя эмпирические данные об эффективности паттернов.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы в области микроконтактной печати, химии поверхности и контроля микрофлюидного потока.
- Необходим доступ к инвертированному микроскопу с проходящим светом, высокоскоростной камере и инструментам отслеживания частиц на базе MATLAB.
- Требуется межкомандная стандартизация изготовления подложек и отчетности об условиях потока для обеспечения воспроизводимости результатов в разных центрах.
- Адаптация для альтернативных типов клеток требует валидации пар лиганд-рецептор и оптимизации параметров напряжения сдвига.
- Метод ограничен транзиторным характером взаимодействий клеток с краем, что затрудняет полную реконструкцию траектории и требует сегментированного анализа.
