Физиологические, морфологические и нейрохимические Характеристика нейронов модулируется движением
21 апреля 2011 г.
Методика описана количественно в естественных условиях физиологическую реакцию у млекопитающих нейронов во время движения и соотносить физиологии нейрона с нейронной морфологии, нейрохимические фенотип и синаптических микросхемы.
Общая цель данной процедуры заключается в регистрации физиологического ответа отдельных нейронов во время движения с последующей характеристикой морфологии и нейрохимии этих нейронов. Для этого сначала проводят анестезию и хирургическую подготовку животного. Следующим этапом является электрофизиологическая регистрация внутриклеточного ответа отдельных нейронов во время движения.
После перфузии животного и обработки мозга заключительным этапом является визуализация и анализ физиологического ответа и морфологии нейронов. В конечном итоге сочетание методов внутриклеточной регистрации нейронной активности, иммунохимии и анализа позволяет выявить модуляцию мембранного потенциала отдельных нейронов во время движения. Основным преимуществом данной методики перед существующими методами, такими как культура клеток, является сохранение нейронных связей и синаптических входов, а также тот факт, что нейроны не подвергаются эксцизии и не помещаются в искусственные среды. За день до проведения эксперимента в периферические целевые области вводится нейрональный трейсер, например, пероксидаза хрена, для ретроградного мечения мотонейронов.
На следующий день подвергните крысу общей анестезии и поместите её на грелку; используя асептическую технику, выбрейте шерсть на коже над затылочной частью черепа с помощью машинки для стрижки животных. Сделайте разрез вдоль внутренней поверхности бедра и введите канюлю в бедренную вену для подачи дополнительной анестезии. Введите другую канюлю в бедренную артерию для мониторинга артериального давления.
Наконец, введите канюлю в трахею. Затем поместите крысу в стереотаксическую раму. Выполните краниотомию для обнажения мозжечка, стараясь не повредить большой венозный синус, расположенный непосредственно под местом соединения теменных и межтеменных костей.
Затем покройте поверхность головного мозга подогретым минеральным маслом. Теперь прикрепите нижнюю челюсть к стержню, соединенному с электромагнитным вибратором. Движение нижней челюсти контролируется командными сигналами, подаваемыми на вибратор от генератора сигналов.
Затем поместите заземляющий электрод под кожу рядом с местом краниотомии. Для подготовки внутриклеточных электродов заполните микроэлектроды раствором красителя IDE или тетраэтилдиамина. Импеданс электрода должен составлять от 60 до 80 МОм для аксонов большого диаметра и от 80 до 150 МОм для малых афферентных аксонов и интернейронов.
Затем с помощью небольшого телескопа, зафиксированного за головой животного, введите микроэлектрод в головной блок электрометра. Визуализируйте микроэлектрод через 20-кратный окуляр телескопа. Целевая область находится примерно в 0,5 millimeters к медиальной стороне от нижней границы нижнего двухолмия.
Теперь сделайте небольшое отверстие в мягкой мозговой оболочке, чтобы точно определить поверхность мозга. Увеличьте компенсацию емкостной обратной связи таким образом, чтобы при касании электродом мозга вырабатывался сигнал обратной связи. Медленно продвигайте электрод до его введения в ткань мозга.
Следующий шаг заключается в активации повторяющегося смещения нижней челюсти. Затем с помощью шагового двигателя введите электрод в мозг. Когда прокол нейрона будет обозначен внезапным падением потенциала постоянного тока и продолжающейся синаптической активностью, прекратите продвижение электрода.
Когда проникновение будет признано стабильным, начните выполнение движений челюсти по типу «подъем-удержание» и синусоидальных движений. Запишите нейронный ответ и определите тип нейрона на основе этого ответа. Затем, чтобы картировать рецептивное поле нейрона, используйте тупой зонд для исследования кожи вокруг головы и полости рта.
Изучите реакцию нейрона на другие стимулы, такие как сокращение мышц или ноцицептивные раздражители. По завершении регистраций подайте постоянный ток силой от 1 до 4 nA до достижения общего заряда инъекции от 15 до 70 nA·мин. Контролируйте проникновение электрода и прекратите подачу тока.
Если мембранный потенциал становится более положительным, чем минус 30 милливольт, следующим этапом является секционирование тканей мозга. После эвтаназии и перфузии животного извлеките мозг. Затем сделайте срезы толщиной от 50 до 100 микрон в фронтальной, сагиттальной или горизонтальной плоскости.
Для визуализации взаимосвязи между меченым сенсорным нейроном и различными моторными нейронами обработайте ткань с помощью H-R-P-D-A-B или Texas red, в зависимости от типа ткани; дополнительный анализ можно провести с помощью флуоресцентного или конфокального микроскопа или с использованием программного обеспечения для количественного анализа колокализации. При необходимости можно провести иммунохимическую обработку на синаптофизин для точного определения локализации синапсов внутри меченых нейронов. На данном рисунке показан нейрон ствола мозга, в который был введен IDE после электрофизиологической характеристики.
Основываясь на нейронном ответе во время движения, данный нейрон можно идентифицировать как вторичный афферентный нейрон мышечного веретена. Коричневый контур обозначает расположение двигательного ядра тройничного нерва. На данном рисунке показан физиологический ответ сенсорного нейрона при смещении нижней челюсти.
Ответ нейрона представлен в виде мгновенной частоты разрядов. Обратите внимание, что этот ответ практически полностью повторяет смещение нижней челюсти, что указывает на то, что данный конкретный нейрон обеспечивает сенсорную обратную связь, связанную с положением нижней челюсти. На данном рисунке показан сенсорный нейрон, который реагировал во время зондирования мышцы.
Нейрон был окрашен с помощью ide после иммунохимической обработки. Синаптические батоны, выглядящие как красные утолщения, колокализованы с желтым синаптофизином. Зеленый цвет соответствует флуоресцентному маркеру.
На данном рисунке представлена анимация аксона первичного афферентного нейрона мышечного веретена. Для создания анимации были использованы многочисленные оптические срезы маркированного нейрона. После выполнения данной процедуры могут быть применены другие методы, такие как электронная микроскопия, конфокальная микроскопия, а также антероградное или ретроградное маркирование нейронов, для получения дополнительных ответов на вопросы об ультраструктурных характеристиках нейрона, колокализации нейромедиаторов с синаптическими пузырьками и связях между нейронами.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье описывается метод количественной оценки физиологического ответа нейронов млекопитающих in vivo во время движения. Этот метод позволяет сопоставить физиологию нейронов с их морфологией, нейрохимическим фенотипом и синаптической микроструктурой.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронаука
- Электрофизиология
- Нейроанатомия
Теоретические основы
- Регистрация физиологических ответов нейронов имеет решающее значение для понимания их функций.
- Существующие методы часто нарушают нейронные связи.
- Данный метод позволяет сохранить естественную среду нейронов.
- Для маркировки конкретных нейронов с целью их изучения используются нейронные трейсеры.
Цель исследования
- Для регистрации физиологического ответа отдельных нейронов во время движения.
- Для характеристики морфологии и нейрохимии этих нейронов.
- Для анализа взаимосвязи между активностью и структурой нейронов.
Используемые методы
- Анестезия и хирургическая подготовка животного.
- Электрофизиологическая регистрация внутриклеточных ответов во время движения.
- Перфузия животного и подготовка мозга к анализу.
- Визуализация и анализ морфологии нейронов и физиологических ответов.
Основные результаты
- Продемонстрированы модуляции мембранного потенциала нейронов во время движения.
- Показано сохранение нейронных связей и синаптических входов.
- Комбинированные методы позволили получить представление о поведении нейронов.
- Выделены преимущества перед традиционными методами культивирования клеток.
Выводы
- Данный метод предлагает новый подход к изучению физиологии нейронов in vivo.
- Он позволяет глубже понять взаимосвязь между активностью и морфологией нейронов.
- Результаты данной работы могут стать основой для будущих исследований различных функций нейронов.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Понимание того, как отдельные нейроны реагируют во время движения, имеет решающее значение для снижения рисков при валидации мишеней в разработке нейрофармакологических препаратов. Данный метод позволяет получить представление о механизмах работы за счет корреляции физиологической активности с морфологией и нейрохимией в целостных цепях, что повышает прогностическую уверенность в воздействии на мишень. Он восполняет критический пробел в сенсомоторных исследованиях, где статические или внеклеточные методы не позволяют зафиксировать функциональную динамику во время поведения.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы, связывая паттерны нейронного разряда во время движения со специфическими типами клеток и путями.
- Операционная ценность: способствует снижению биологических рисков за счет прямого наблюдения за модуляцией нейронов в физиологически релевантных условиях.
- Прогностическая ценность: повышает уверенность в выборе мишени за счет характеристики нейрохимических фенотипов и синаптической связности модулируемых нейронов.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: Подготовка валидированных нейронных систем с количественно определенными физиологическими ответами для последующего скрининга соединений.
- Воспроизводимость: Стандартизация морфологической и нейрохимической характеристики для обеспечения согласованности результатов в различных экспериментах.
- Масштабируемость: Облегчение повторного использования платформы за счет детального картирования нейронов, которое может быть совмещено с иммунохимией или электронной микроскопией для мультиплексного анализа.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная непрерывность: связывает этап открытия и доклиническую валидацию за счет сохранения нативных цепей в ходе исследований двигательной активности in vivo.
- Механистическое снижение рисков: уменьшает неопределенность в определении функции мишени путем корреляции активности с ультраструктурными особенностями и синаптическими входами.
- Продвижение с учетом рисков: обосновывает решения о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) на основе комплексного профилирования нейронов, что способствует согласованию биомаркеров и валидации сигнальных путей.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод интегрируется в процесс поиска лекарственных средств — от ранней валидации мишени до доклинической характеристики — обеспечивая получение структурных и функциональных данных о нейронах, активных во время движения.
- Открытия в биологии: способствует проверке гипотез и уточнению путей передачи сигналов путем записи внутриклеточных ответов во время определенных двигательных актов, таких как движение челюсти.
- Скрининг: обеспечивает готовность анализа за счет воспроизводимой визуализации и количественной оценки морфологии нейронов и физиологической модуляции.
- Аналитика: предоставляет количественные измерения мембранного потенциала и данные о нейрохимической колокализации, что позволяет проводить объективное сравнение состояний нейронов.
- Трансляционные исследования: связывает результаты с доклинической работой за счет сохранения синаптических микроцепей, обеспечивая преемственность от физиологического ответа к структурной валидации.
- Корпоративное повторное использование: функционирует как универсальная платформа для характеризации, применимая к сенсорным, моторным и интернейронным системам в различных моделях заболеваний.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: обеспечивает прогностическую достоверность за счет снижения механистической неопределенности путем корреляции физиологии, морфологии и нейрохимии.
- Практическая ценность: гарантирует стандартизацию и воспроизводимость благодаря фиксированной хирургической подготовке, протоколам установки электродов и этапам обработки тканей.
- Стратегическая ценность: повышает эффективность использования капитала, позволяя на ранних этапах снизить риски при работе с мишенями за счет комплексной характеризации нейронов in vivo.
- Влияние на портфель: поддерживает приоритезацию с учетом рисков, предоставляя мультимодальные данные, которые лежат в основе принятия решений по выбору и продвижению мишеней.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области внутриклеточной электрофизиологии, хирургической подготовки и методов введения нейрональных трейсеров.
- Необходима специализированная аппаратура, включая электрометры, генераторы сигналов, шаговые двигатели и системы микроскопии для световой, электронной или конфокальной визуализации.
- Требуется межгрупповая стандартизация протоколов анестезии, методов перфузии и секционирования тканей для обеспечения согласованности данных.
- При применении данного метода для различных типов нейронов или областей мозга, помимо тройничной системы, необходимо учитывать особенности адаптации техники.
- Ограничено технической сложностью поддержания стабильных внутриклеточных записей при движении, что зависит от импеданса электрода и стабилизации мозга.
