Физиологические, морфологические и нейрохимические Характеристика нейронов модулируется движением

Методика описана количественно в естественных условиях физиологическую реакцию у млекопитающих нейронов во время движения и соотносить физиологии нейрона с нейронной морфологии, нейрохимические фенотип и синаптических микросхемы.

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы записать физиологическую реакцию отдельных нейронов во время движения и в дальнейшем охарактеризовать морфологию и нейрохимию этих нейронов. Это достигается путем предварительной анестезии и хирургической подготовки животного. Следующим шагом является электрофизиологическая запись внутриклеточного ответа отдельных нейронов во время движения.

После перфузии животного и обработки мозга заключительным этапом является визуализация и анализ физиологической реакции и морфологии нейронов. В конечном счете, методы записи внутриклеточных нейронов, иммунохимии и анализа в совокупности показывают модуляции мембранного потенциала отдельных нейронов во время движения. Основное преимущество этой техники перед существующими методами, такими как клеточная культура, заключается в том, что нейронные связи и синаптические входы сохраняются, а нейроны не автотомизируются и не помещаются в искусственные среды.

На следующий день обезболивают крысу и кладут ее на грелку, бреют кожу, покрывая заднюю часть черепа машинками для стрижки животных в асептической технике. Сделайте разрез вдоль внутренней поверхности бедра, вставьте канюлю в бедренную вену для дополнительной анестезии. Вставьте еще одну канюлю в бедренную артерию для контроля артериального давления.

Наконец, вставьте канюлю в трахею. Далее поместите крысу в стереотаксическую рамку. Выполните трепанацию черепа, чтобы обнажить мозжечок, стараясь избегать большого венозного синуса, расположенного непосредственно под соединением между теменной и межтеменной костями.

Далее покройте поверхность мозга подогретым минеральным маслом. Теперь приклейте нижнюю челюсть к стержню, соединенному с электромагнитным вибратором. Движение нижней челюсти контролируется командными сигналами на вибратор от генератора сигналов.

Затем поместите заземляющий электрод под кожу, прилегающую к краниотомии. Чтобы подготовиться к внутриклеточным электродам, протяните заполнение микроэлектродов с IDE или тестом на раствор красителя тетраэтилового стержня Domine. Этот импеданс электродов составляет от 60 до 80 мегаом для аксонов большого диаметра и от 80 до 150 мегаом для малых афферентных аксонов и интернейронов.

Затем поместите микроэлектрод в головной столик электрометра с помощью небольшого телескопа, который закреплен за головой животного. Визуализируйте микроэлектрод через 20-кратный красный экран телескопа. Целевая площадь составляет около 0,5 миллиметра до нижней границы нижнего холмика.

Теперь сделайте небольшое отверстие в мозговой оболочке, чтобы обеспечить точное местоположение поверхности мозга. Сверхкомпенсируйте емкостную обратную связь, чтобы при касании электрода с мозгом производился сигнал обратной связи. Продвигайте электрод до тех пор, пока он не войдет в мозг.

Следующим этапом является активация многократного смещения нижней челюсти. Затем с помощью шагового мотора продвигайте электрод в мозг. Когда на прокалывание нейронов указывает внезапное падение потенциала постоянного тока и продолжающаяся синаптическая активность, прекратите продвижение электрода.

Когда проникновение считается стабильным, начните движения рампы и удержания и синусоидальные движения челюсти. Запишите реакцию нейронов и охарактеризуйте нейрон на основе его реакции. Затем, чтобы составить карту рецептивного поля нейрона, используйте тупой зонд для исследования кожи вокруг головы и внутриротовой полости.

Исследуйте реакцию нейрона на другие раздражители, такие как сокращение мышц или вредные раздражители. Когда запись будет завершена, введите от одного до четырех наноампер постоянного тока, чтобы общая мощность инжекции составила от 15 до 70 наноампер минут. Контролируйте проходку электрода и прекратите подачу тока.

Если мембранный потенциал становится более положительным, чем минус 30 милливольт, следующим этапом является рассечение мозговой ткани. После усыпления и перфузии животного удалите мозг. Затем разрежьте срезы размером от 50 до 100 микрон в лобной, сагиттальной или горизонтальной плоскости.

Чтобы визуализировать взаимосвязь между меченым сенсорным нейроном и различными моторными нейронами, обработать ткань на H-R-P-D-A-B или техасский красный, в зависимости от ткани, дополнительные анализы могут быть проведены с помощью флуоресцентного или конфокального микроскопа или с помощью программного обеспечения для количественной колокализации. При желании может быть выполнена иммунохимическая обработка синаптофизина, чтобы точно локализовать синапсы внутри меченых нейронов. На этом рисунке показан нейрон ствола мозга, в который была введена IDE после электрофизиологической характеристики.

Основываясь на реакции нейронов во время движения, этот нейрон может быть идентифицирован как вторичный афферентный нейрон мышечного веретена. Коричневым контуром обозначено расположение моторного ядра тройничного нерва. На этом рисунке показана физиологическая реакция сенсорного нейрона во время смещения челюсти.

Реакция нейрона представлена в виде мгновенной частоты возбуждения. Обратите внимание, что реакция точно имитирует смещение нижней челюсти, указывая на то, что этот конкретный нейрон обеспечивает сенсорную обратную связь, связанную с положением нижней челюсти. На этом рисунке показан сенсорный нейрон, который отреагировал во время зондирования мышц.

Нейрон окрашивали идом после иммунохимической обработки. Видны синаптические палочки, проявляющиеся в виде красных вздутий, локализованных вместе с желтым синаптофизином. Зеленый цвет — флуоресцентное пятно от ракеты.

Этот рисунок представляет собой анимацию аксона из мышечного веретена первичного афферентного нейрона. Для создания анимации были использованы несколько оптических участков помеченного нейрона. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как электромикроскопия, конфокальная микроскопия и передняя степень или ретроградное мечение нейронов, чтобы ответить на дополнительные вопросы об ультраструктурных характеристиках нейронной колокализации нейротрансмиттеров с синаптическими BNS и нейронными связями.