Липидов везикул-опосредованной аффинной хроматографии с использованием магнитных Активированный сортировки клеток (LIMACS): новый метод для анализа Белково-липидные взаимодействия

Данный эксперимент предназначен для идентификации липид-связывающих белков и анализа взаимодействия белков с липидами в определенном мембранном окружении из липидных везикул. Белки клеточного гомогената инкубируют со свежеприготовленными липидными везикулами из фосфатидилсерина и церамида. Затем в реакционную смесь добавляют магнитные бусины, конъюгированные с анти-X-белком, чтобы закрепить белки, связанные с липидными везикулами, на магнитных бусинах. После этого белки и липидные везикулы очищают с помощью магнитной сепарации клеток (MACS).

Для подтверждения результатов по идентификации липид-связывающих белков используйте вестерн-блоттинг с ЭФС (SDS-PAGE), чтобы продемонстрировать очистку эндогенной и рекомбинантной атипичной PKC, а также специфического церамид-связывающего домена, экспрессированных в клетках MDCK. Основным преимуществом этого нового метода по сравнению с существующими, такими как ELISA или спектроскопия поверхностного плазмонного резонанса, является то, что взаимодействие липида и белка происходит в мембраноподобном окружении, а связывающие белки могут быть очищены и проанализированы. Значение данного метода распространяется на терапию и диагностику заболеваний, связанных с липидами, поскольку при таких патологиях физиологическое взаимодействие белков с липидами нарушено.

Для некоторых из этих заболеваний белки-мишени даже не известны и требуют идентификации. Для разработки терапии на основе липидов начните с приготовления липидных SLE из высушенной смеси эквимолярных количеств фосфатидилсерина и церамида C16 в 100 µL сикального буфера. После добавления 300 µL сикального буфера с добавлением 0,1 мM хлорида марганца подвергните смесь воздействию ультразвука в течение одного часа. Центрифугируйте образцы при 12 000 ×g в течение 20 минут при 4 °C, затем ресуспендируйте осадок крупных липидных везикул в 100 µL сикального буфера. Добавьте 1 нМ флуоресцентного красителя vibrant cm DII и инкубируйте при 37 °C в течение одного часа для облегчения визуализации фракции SLE после сепарации на магнитных частицах. Соберите розовый осадок окрашенных vibrant cm dai фосфатидилсерин-церамидных SLE путем центрифугирования и ресуспендируйте в 100 µL Трис-буфера.

Далее, для приготовления клеточного лизата, не содержащего детергентов, подвергните клетки соникации в 300 µL гипертонического буфера (10 mM Tris-HCl), содержащего ингибиторы протеаз и фосфатаз, и центрифугируйте. Чтобы удалить мембранный дебрис, добавьте прозрачный клеточный лизат в физическую суспензию липидов и инкубируйте смесь в течение двух часов при 4 °C. Поскольку клеточные лизаты могут содержать эндогенные мембраны с фосфатерином, рекомендуется очистить лизат от этих мембран с помощью дополнительных этапов центрифугирования.

Добавьте в реакционную смесь 20 µL буфера для связывания XNV и 50 µL раствора, содержащего магнитные частицы, конъюгированные с XNV; инкубируйте в течение одного часа при 4 °C, затем проведите магнитную сортировку активированных клеток согласно протоколу производителя. Далее с помощью флуориметра для микропланшетов проконтролируйте интенсивность флуоресценции CM DII в протекающих и элюируемых фракциях, чтобы определить наличие и количество липидных везикул в анализе конкуренции антител. Для проверки специфичности реакции связывания A PKC с везикулами церамид-фосфосерина инкубируйте 1 µg кроличьих поликлональных антител к anti P KC Zeta с клеточным лизатом в течение одного часа при 4 °C, после чего проведите инкубацию с липидными везикулами.

Перейдите к электрофорезу в ПААГ-SDS и иммуноблоттингу для анализа связывания белка с остатками фосфатидилсерин-церамида в максимальном элюате для in vitro реконструкции жидкостно-белкового полярного комплекса. Начните с подготовки розового осадка везикул фосфатидилсерин-церамида, окрашенных красителем vibrant cm DII, как показано ранее; ресуспендируйте везикулы в 100 µL Трис-буфера, дополненного 100 µM γ-S-GTP, 1 mM GDP и смесью интересующих рекомбинантных белков. Затем инкубируйте реакционную смесь при 4 °C в течение трех часов. Далее добавьте 5 µL 20-кратного стокового раствора буфера X in V и 50 µL магнитных частиц, конъюгированных с X in V.

Инкубируйте смесь при осторожном перемешивании еще в течение 30 минут при температуре 4 °C. Продолжите выполнение магнитной сепарации клеток NX NV в соответствии с протоколом производителя для обеспечения осаждения. Добавьте к элюированной фракции 10 мкг чистого e albumin.

Концентрируйте белки методом осаждения по Вейлу-Флюэ. Нижняя фаза состоит из смеси хлороформа и метанола с обогащенным vibrant cm dii. Коричневый интерфейс содержит магнитные частицы и осажденный белок.

Количественно определите липидные везикулы путем детектирования розового, ярко выраженного cm dii в органической фазе хлороформ-метанол в ходе реакции вейла флу. Используйте равные количества липидных везикул для нормализации содержания белка между образцами и проведите анализ с помощью SDS-PAGE и иммуноблоттинга.

Лизат клеток MDCK, полученный без использования детергентов, экспрессирующих полноразмерный PKC Zetta, C-концево связанный с зеленым флуоресцентным белком или керамид-связывающим доменом. C-конец PKC Zetta был инкубирован с фосфосерином.

После элюции из колонки Max везикулы церамида были проанализированы методом иммуноблоттинга. Фрагмент связывания церамида C20 Zeta, EGFP и полноразмерный PKC Zeta были выделены из элюата колонки Max, что подтверждает специфичность и эффективность процедуры элюции. Отрицательный контроль EGFP, который не связывался с фосфатидными везикулами церамида сирийских хомяков, в элюате обнаружен не был.

При дополнении метода Linx другими методами, такими как SDS-PAGE, вестерн-блоттинг или протеомный анализ, можно получить ответы на дополнительные вопросы, например, о том, какие белки входят в комплекс липид-связывающих белков. После разработки LabX открыла перед исследователями в области изучения одиночных липидов возможности для изучения церамид-индуцированного апоптоза и полярности клеток в нейральных стволовых и эпителиальных клетках.